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昆虫病原真菌是指寄生于昆虫并引起昆虫死亡的一类真菌,由于其对害虫致病性强、在害虫个体间传播速度快、对环境友好性高等特点而被广泛应用于农业生产中的病虫害防治。罗伯茨绿僵菌是一种广谱杀虫真菌,它的致病力强,对农作物无害且容易大规模生产。但是对于罗伯茨绿僵菌的遗传改造一直受到其同源重组效率过低因素的限制。而以锌指核酸酶和TALEN为代表的核酸内切酶虽然可以达到进行基因组编辑的目的,但其成本过高,操作流程复杂,难以达到对基因组进行快速高效编辑的目的。CRISPR/Cas9是近年来兴起的研究热门,它具有操作简单,成本低廉等特点,使得高效编辑罗伯茨绿僵菌基因组成为一个可实现的目标。本研究的目的是在罗伯茨绿僵菌中建立有效的CRISPR/Cas9基因组编辑系统,将Cas9蛋白序列及sgRNA序列通过农杆菌转化法导入罗伯茨绿僵菌中,并检验其编辑功能的效果,主要取得了以下几点结果:(1)从与罗伯茨绿僵菌相近虫生真菌构建的CRISPR/Cas9系统文献中得到Cas9蛋白基因序列,对Cas9蛋白基因序列进行优化,最后得到适合导入罗伯茨绿僵菌的Cas9蛋白基因序列;(2)分两步先将Cas9蛋白的基因序列导入罗伯茨绿僵菌,再导入sgRNA序列,靶位点位于绿僵菌的多铜氧化酶基因;反转录显示Cas9蛋白基因序列成功转录为mRNA,但转化子的表型及测序结果显示CRISPR/Cas9系统并未编辑靶位点基因;(3)对两步构建CRISPR/Cas9系统进行改进,将Cas9蛋白基因序列和sgRNA序列连接至一个质粒上,靶位点位于质粒上的绿色荧光蛋白基因序列,再将质粒导入罗伯茨绿僵菌。对导入质粒的菌株进行蛋白印记检测表明Cas9蛋白成功表达,在紫外下对菌株进行荧光显微观测,发现可以观察到绿色荧光蛋白。说明构建的CRISPR/Cas9系统未对绿色荧光蛋白基因的靶位点进行切割。综上所述,针对罗伯茨绿僵菌构建的CRISPR/Cas9基因编辑系统并未成功编辑靶基因位点,但是Cas9蛋白在绿僵菌细胞内的存在得到了验证。后续对sgRNA的U6启动子序列进行分析并与绿僵菌序列进行比对,发现了罗伯茨绿僵菌序列中的U6启动子序列。后续的实验可以将一步构建法的bar质粒中的U6启动子替换为罗伯茨绿僵菌内源的U6启动子。基于现有的研究热点,本研究结合CRISPR/Cas9基因编辑系统旨在罗伯茨绿僵菌中建立一个高效、快速、易于操作的基因组编辑技术。虽然最终该系统并未成功构建,但是对后续罗伯茨绿僵菌CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立以及进一步的改进打下了坚实的基础。