论文部分内容阅读
背景:对于有机磷和氨基甲酸酯类农药的农残快速检测,酶抑制法是当前国内外研究最多的,也是最简便、灵敏、经济、快速的一种检测方法。其中乙酰胆碱酯酶(acetylcho 1 inesterase,AChE)的活性受到有机磷和氨基甲酸酯类农药的特异性抑制,故而成为监控有机磷和氨基甲酸酯类农药的靶酶。本文基于Schulze等人对目前已被研究的乙酰胆碱酯酶酶源进行比较分析的结果,发现市面上常见的农药对人和果蝇乙酰胆碱酯酶的双分子速率常数较其他酶源要高很多,证明人和果蝇的乙酰胆碱酯酶酶源对农药更敏感,因此本实验采用人和果蝇来源的乙酰胆碱酯酶作为本实验研究对象。目前,乙酰胆碱酯酶主要从昆虫组织或者动物血液中提取,存在产量低、成本高且分离纯化困难,最重要是灵敏度差异比较大,因此寻找一种低成本高效的生产系统显得尤为重要。毕赤酵母表达系统表达的蛋白一般都具有蛋白活性,而且具有高密度发酵、原料成本低廉、基因遗传稳定性高、表达效率高等特点,最关键的是可以实现分泌表达和翻译后加工修饰,可以满足工业化大量生产乙酰胆碱酯酶的需求。目前该系统已经得到了大量推广和应用。目的:本实验利用毕赤酵母分泌表达系统分别对来自人和果蝇的乙酰胆碱酯酶基因进行分泌表达,并初步评估了其对市面上常见8种农药的敏感性大小。初步对这两个来源的乙酰胆碱酯酶进行实验室水平的探索研究,为工业化大规模生产高敏感性乙酰胆碱酯酶奠定基础。方法:本文为了实现人和果蝇乙酰胆碱酯酶基因在毕赤酵母中的分泌表达,根据Genbank上已发表的人和果蝇乙酰胆碱酯酶基因的核酸序列分别设计引物F1/R1和F2/R2,采用高保真PCR和RT-PCR技术分别扩增出hAChE和dmAChE的开放阅读框(ORF)片段,选取毕赤酵母表达载体pPIC9K,利用SnaB Ⅰ和Avr Ⅱ双酶切分别将其克隆至载体pPIC9K中构建成重组质粒,重组质粒经菌落PCR和双酶切验证并测序分析后,经Sal Ⅰ酶分别线性化后电穿孔将其转化至毕赤酵母GS115中。采用MD平板筛选HIS+阳性转化子,并用含有G418抗性梯度的YPD平板进行多拷贝菌株筛选,菌落PCR进行阳性验证,最终分别在4.0 mg/mL G418 YPD抗性平板上筛选到人和果蝇AChE 阳性多拷贝酵母表达菌株,采用通用引物进行Mut表型验证,结果表明 GS11 5/PPIC9K-hAChE 为 Muts 型,GS115/pPIC9K-dmAChE为Mut+型,对重组酵母菌株分别进行0.5%甲醇诱导表达,利用Q-sepharose FF柱层析法对发酵表达产物进行纯化,获得了较纯的乙酰胆碱酯酶。对发酵表达产物进行SDS-PAGE蛋白凝胶图谱分析,并应用改良的Ellman法对发酵表达产物进行酶活测定和Bradford法进行蛋白含量测定。本文还通过初步计算比对GS115/pPIC9K-hAChE和GS115/pPIC9K-dmAChE重组工程菌发酵上清液对乐果、敌敌畏、甲胺磷、敌百虫、马拉硫磷、甲萘威、毒死蜱、克百威的IC50,最终进行酶源敏感性效度评估。结果:GS115/pPIC9K-hAChE在65 kDa处有一条明显蛋白条带,大小与预期hAChE蛋白一致。且hAChE蛋白质含量为1.33 mg/mL,含量占总蛋白的5.58%。最高比酶活达到1080 U/mL。GS115/pPIC9K-dmAChE在67 kDa处有一条明显蛋白条带,大小与预期dmAChE蛋白一致。且dmAChE蛋白质含量为2.52mg/mL,含量占总蛋白的10.58%。dmAChE蛋白最高比酶活达到 1914 U/mL。得出GS115/pPIC9K-hAChE对8种农药IC50结果如下:敌百虫>敌敌畏>克百威>马拉硫磷>乐果>甲胺磷>甲萘威>毒死蜱即人乙酰胆碱酯酶对毒死蜱最敏感。得出GS115/pPIC9K-dmAChE对8种农药IC50结果如下:乐果>甲胺磷>克百威>马拉硫磷>敌敌畏>甲萘威>敌百虫>毒死蜱。即果蝇乙酰胆碱酯酶对毒死蜱最敏感。