水稻细菌性条斑病菌中组氨酸代谢关键基因及耐盐基因的鉴定和功能分析

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水稻黄单胞菌隶属于黄单胞属(Xanthomonas),包含两个致病变种Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)和 X oryzae pv.oryzicola(Xoc),在水稻上分别引起白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)和细菌性条斑病(bacterial leaf streak,BLS)。此次研究通过基因序列分析及克隆,并利用同源双交换原理构建相应基因的缺失突变菌株,通过与野生型菌株的表型差异分析,进而推知该基因在水稻条斑病菌中的相应功能。(一)代谢通路分析以及基因注释表明,Xoc中存在负责组氨酸生物合成的his基因簇和负责组氨酸降解的hut基因簇。基因同源性比对分析表明这两套基因簇在黄单胞菌中是高度保守的。通过同源双交换方式获得相应缺失突变菌株,并对其进行了致病性测定,发现hut基因簇相关基因缺失突变后均不影响水稻细菌性条斑病菌的致病能力,而his基因簇相关基因缺失突变后均降低了水稻条斑病菌的致病能力,其中以hisB尤为显著,且hisB的缺失突变并不影响在非寄主烟草上的过敏反应。通过基础培养基中组氨酸营养缺陷分析,我们进一步证明了his基因簇是Xoc中组氨酸的生物合成关键基因簇。此外,发现组氨酸生物合成双功能蛋白hisB是Xoc毒力及黄色素形成所必需的,该基因缺失突变后,在250 μm组氨酸处理条件下的5个毒性基因(wxocB、purF、pgK、tal-10C-like、trpA)和四个莽草酸途径相关基因(xanB2、aroE、aroA、aroK)的转录表达水平均下降。研究首次发现了 hisB在Xoc致病性及黄色素形成中的功能。(二)生物对环境因素都有一定的耐受范围,超过耐受限度,将会影响生物的生存和繁殖。在自然界里,病原细菌也常会遇到来自环境的胁迫,物理学、生物学及化学等相关因素对细菌的代谢活动以及相关酶的活性产生各种不同的影响,促使细菌进化出自身的生理与遗传适应机制来提高在逆境条件的适应性,从而能成功地在寄主上生存与繁殖。因此探索这些适应机制,可以为进一步探索微生物变异的规律性、以及阐明对温度及药物等理化因子的抗性机制提供理论依据。在水稻白叶枯病菌PX099A菌株中存在一个与病菌耐盐性调控相关的基因(PXO03841),该基因缺失后显著减弱了菌株在NaCl环境中的活力。同源比对结果显示,在水稻黄单胞菌中该基因的氨基酸序列是高度保守的,通过序列分析比对我们找到了该基因在水稻细菌性条斑病菌Rs105中的同源基因(ACU1200945),并构建了该基因在Rs105中的缺失突变菌株,对其进行遗传表型测定。实验结果显示,将ACU1200945基因缺失突变后,也降低了病菌对NaCl的耐受能力。我们以ACU1200945基因为研究对象,从基因水平上对基因功能进行了研究,qRT-PCR结果显示该基因在Rs105野生型菌株中的表达量随菌株周围环境中NaCl浓度的升高而增加,从基因水平上证明了该基因参与Rs105的耐盐调控能力。ACU1200945基因缺失之后同时降低了病菌在KCl的耐受能力,但在CaCl2以及ZnCl2环境中的生长能力与野生型之间无显著差异。实验初步揭示了ACU1200945基因对细胞内的Na+、K+离子具有转运调控能力,在维持细菌细胞内外渗透压的平衡上具有重要作用。研究同时发现该基因的缺失突变也降低了菌体的运动能力。
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