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叶霉病是番茄的一种主要病害,在设施生产条件下,特别是在我国的日光温室中,经常大面积发生,严重地影响番茄的产量和品质。利用寄主对病原菌的过敏反应(Hypersensitive Response,HR)是目前番茄抗叶霉病育种的主要途径。但是番茄叶霉病病菌的生理小种变化较快,给抗病育种带来一定的难度。HR是在抗病基因的编码蛋白与无毒基因编码产物激发子互作后,通过一系列信号传导途径被诱导产生的。许多研究已经表明,HR的信号传导途径在植物中是保守的。因此,研究叶霉病菌Cladosporium fulvum与番茄抗病基因在寄主体内互作以及诱导HR产生的信号传导过程及其相关基因,利用基因工程创造具有广谱抗性的育种材料,可能是番茄抗叶霉病育种的有效途径之一。荷兰瓦赫宁根大学植物病理实验室Cladosporium fulvum研究小组,在研究番茄抗叶霉病基因Cf-4和相应的生理小种的互作反应中,利用cDNA-AFLP分析技术得到了420个差异表达的cDNA片段。本论文利用病毒诱导的基因沉默(Virus-Induced Gene Silencing,VIGS)技术和酵母双杂交技术,对这些cDNA片段进行了筛选和功能研究。主要结果如下: 1.选择了192个利用cDNA-AFLP分析技术获得的差异表达的cDNA片段,用VIGS技术进行了大规模的功能筛选。获得了20个参与过敏反应的cDNA片段,其中15个被沉默后,使Cf-4转基因烟草的HR反应减弱,另有5个被沉默后使HR反应完全丧失,表明这5个基因在HR反应中起关键作用。 2.针对上述筛选出的20个cDNA片段,通过PCR的方法已从番茄的全长cDNA文库中获得了其中的6个cDNA克隆,有两个序列基本相同。它们的编码蛋白分别与来源于辣椒的Bs2抗病基因编码蛋白、拟南芥L19核糖体蛋白、拟南芥的一种GTP结合蛋白、拟南芥的一种TPR蛋白和甘薯的一种LRR(Leucine-Rich Repeat)受体类蛋白激酶具有较高的同源性。其中前三个基因沉默后,使HR反应完全丧失。除GTP结合蛋白和受体类蛋白激酶外,其它3个基因为首次发现参与HR反应。暂将与Bs2抗病基因编码蛋白高度同源的cDNA克隆定名为RGL(Resistance Gene Like)。 3.以RGL作为诱饵蛋白,采用酵母双杂交方法,从番茄全长cDNA文库中筛选出两个与之互作的蛋白,分别命名为RGLIP-1和RGLIP-2(RGL Interacting Protein)。RGHP-1编码291个氨基酸,与拟南芥类囊体内腔蛋白同源性较高,RGLIP-2至少编码248个氨基酸,与拟南芥转导素高度同源。利用VIGS技术对这两个基因进行了功能分析。结果显示RGLIP-1基因沉默后导致了HR反应的减弱,而RGLIP-2基因沉默后使HR反应完全丧失,表明这两个互作蛋白均参与了过敏反应。