第一部分 AMH与PCOS卵泡发育障碍治疗靶点的初步研究　　 目的：卵泡发育障碍是多囊卵巢综合征(PCOS)最常见的临床症状之一，由其所致的月经稀发和不孕是PCOS患者就诊的主要原因，由于PCOS长期不排卵造成子宫内膜癌等远期并发症对女性生殖健康构成严重威胁。针对PCOS卵泡发育障碍机制尚未完全明确及促排卵治疗低效高风险的现状，本研究探讨了PCOS颗粒细胞AMH启动子活性与其过度分泌的关系，从新的角度揭示卵泡发育障碍的病因。并通过研究FSH调节PCOS颗粒细胞AMH转录表达的分子通路，为今后治疗PCOS卵泡发育障碍探索新的靶点。　　 方法：本实验共分为四组：PCOS颗粒细胞、IVM促排卵刺激PCOS颗粒细胞、添加外源性FSH刺激PCOS颗粒细胞、IVF对照颗粒细胞各15例。PCOS颗粒细胞组颗粒细胞在入组前3个月内均未接受过任何促排卵药物刺激或手术治疗，PCOS患者的诊断标准为2003年制定的Rotterdam标准。PCOS+FSH组颗粒细胞也来源于上一组未经促排卵药物刺激行卵泡穿刺术的PCOS患者。但是与前一组不同的是该组颗粒细胞在体外培养过程中添加了外源性的FSH(0.075IU/ml)。该组主要用于观察外源性FSH对PCOS颗粒细胞AMH过度分泌的影响。IVMPCOS组颗粒细胞来源于经内源性FSH促排卵刺激后行卵泡穿刺术的PCOS患者，该组主要用于观察内源性FSH对PCOS颗粒细胞AMH过度分泌的影响。IVF对照组颗粒细胞来源于具有正常月经周期因输卵管因素不孕在本中心行IVF-ET手术的不孕患者，患者均采用长方案进行控制性卵巢刺激。以上各组患者均在B超引导下采用20G取卵针经阴道穿刺8-10mm大小的窦卵泡。在卵泡穿刺过程中采用加肝素的PBS缓冲液冲洗取卵针，收集所有冲洗液用于分离颗粒细胞。颗粒细胞的分离纯化采用密度梯度离心法，之后将分离纯化后的颗粒细胞体外培养48小时，并收集培养液和颗粒细胞进行相关分子生物学检测。分别采用ELISA和qRT-PCR检测AMH分泌水平及mRNA的表达丰度，同时采用qRT-PCR和Western-lot比较各组颗粒细胞AMHRⅡ mRNA和蛋白的表达差异，构建hAMH-Juc双荧光报道基因载体研究AMH启动子活性及FGH对其活性的分子调控通路。　　 结果：收集各组颗粒细胞培养液测定AMH分泌水平为：PCOS颗粒细胞组11.41±3.99ng/ml、PCOS颗粒细胞添加外源性FSH组7.91±1.09ng/m1、PCOSIVM颗粒细胞组5.62±1.71ng/ml、IVF对照颗粒细胞组4.78±0.94ng/ml。收集颗粒细胞提取总RNA测定AMH mRNA的表达丰度，结果显示PCOS颗粒细胞组AMH mRNA表达丰度显著高于IVF对照组，添加外源性FSH或IVM方促排卵刺激均能够抑制PCOS颗粒细胞AMH mRNA的转录表达，尤其以后者的抑制效果更显著。PCOS颗粒细胞组AMHRⅡ mRNA的表达丰度显著高于IVF对照组，添加外源性FSH或IVM促排卵刺激对其表达无显著影响。收集颗粒细胞提取总蛋白测定AMHRⅡ的蛋白表达水平，其结果与mRNA表达一致。PCOS颗粒细胞组AMHRⅡ蛋白表达水平显著高于IVF对照组，添加外源性FSH或IVM促排卵刺激对其表达无显著影响。构建hAMH-luc载体检测PCOS颗粒细胞AMH启动子活性显著高于对照组，而添加外源性FSH能够显著抑制AMH启动子活性。　　 结论：AMH启动子活性异常增高所致的转录水平增加是导致PCOS颗粒细胞AMH过度分泌的重要原因。FSH能够抑制PCOS颗粒细胞AMH启动子活性和转录表达，削弱其对卵泡生长发育的抑制作用从而达到促排卵的目的，但对AMHRⅡ的影响不大。本研究从新的角度解释了FSH的促排卵机制，可能为PCOS卵泡发育障碍的治疗提供新的靶点。　　 第二部分LH升高和非升高型PCOS患者AMH分泌特点及卵泡发育障碍机制比较　　 目的：多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄期妇女最常见的妇科疾病之一，由卵泡发育障碍所致的不孕、月经稀发或闭经是患者就诊的主要原因[1-3]。由于临床表现的异质性，先前就有学者提出PCOS患者可以分为两种类型，LH升高型和非升高型。这两种亚型的患者都存在不同程度的排卵障碍，本研究比较这两种亚型AMH的分泌特点及卵泡发育障碍的机制。　　 方法：本研究共纳入95名PCOS患者，患者的纳入标准为2003制定的Rotterdam标准。根据LH/FSH比值将PCOS患者分为LH升高型(LH/FSH≥2)和非升高型(LH/FSH＜2)。其中LH升高型49例，LH非升高型46例。研究还纳入62名具有正常月经周期输卵管性不孕的患者作为对照组。所有研究对象均测定BMI指数，并采用ELISA和化学发光法测定血清中AMH、卵巢性激素、糖脂代谢生化指标及慢性炎症因子的水平。采用单因素方差分析法比较各组间生化代谢指标的差异，采用简单相关分析法和多重线性回归分析法研究AMH与各生化代谢指标的关系。　　 结果：LH非升高型PCOS患者的BMI、空腹胰岛素、HOMA-IR、TG、TG/HDL水平均显著高于LH升高型和对照组，而LH升高型PCOS患者的LH、LH/FSH、T水平均显著高于LH非升高型和对照组。通过比较各组AMH血清水平发现，LH升高型PCOS患者、LH非升高型PCOS患者及对照组患者血清AMH水平分别为7.23±4.34 ng/ml、5.23±3.76 ng/ml、3.74±2.25ng/ml。PCOS组患者血清AMH水平显著高于对照组，且LH升高型高于非升高型。两种亚型的PCOS患者AMH血清水平均显著高于对照组，但是LH升高型PCOS患者的AMH血清水平又显著高于LH非升高型。此外，PCOS患者血清CRP和IL-6水平均显著高于对照组，但两种亚型之间并无统计学差异。　　 采用Pearson相关法分析LH升高型PCOS患者AMH血清水平与各生化指标的关系，结果显示LH升高型PCOS患者的AMH血清水平与E2呈负相关，相关系数为-0.318。LH非升高型PCOS患者的AMH血清水平与BMI、空腹血糖、HOMA-IR呈正相关，相关系数分别为0.493、0.362、0.303，与HDL呈负相关，相关系数为-0.309。采用多重线性回归法控制其它因素的影响后，LH升高型PCOS患者的AMH血清水平与LH/FSH呈正相关，与E2呈负相关，相关系数分别为0.301和-0.429。LH非升高型PCOS患者的血清AMH水平仅与BMI呈正相关，相关系数为0.49。　　 结论：我们首次从AMH的角度揭示了LH升高型和非升高型卵泡发育障碍的机制可能存在差异，这将为PCOS患者个体化治疗方案的制定提供依据。但是由于本研究仅为病例对照研究，无法进一步分析AMH与各临床生化指标的因果关系，因此还需要更大样本的前瞻性研究来证实本研究的结论。　　 第三部分 RNAi抑制高雄激素分泌治疗PCOS卵泡发育障碍在体动物研究　　 目的：17α羟化酶/17，20断裂酶由CYP17基因编码是雄激素代谢途径中的限速酶。CYP17转录水平增加所致的17α羟化酶/17，20断裂酶活性亢进是引起PCOS雄激素过度分泌的重要原因。本研究将CYP17基因选为治疗的靶点，采用RNA干扰技术沉默该基因在大鼠卵巢组织中的表达，部分抑制17α羟化酶/17，20断裂酶的活性，从而抑制卵巢雄激素的过度分泌。　　 方法：针对大鼠CYP17基因构建3条慢病毒shRNA，分别感染体外分离纯化培养的大鼠卵巢膜间质细胞。卵巢膜间质细胞的分离纯化采用密度梯度离心法。慢病毒感染卵巢膜间细胞1周后，采用qRT-PCR和Western-blot技术检测CYP17基因的mRNA和蛋白沉默水平。并采用ELISA技术检测培养液中雄烯二酮的分泌水平，体外筛选出沉默效率最高的慢病毒shRNA用于整体动物实验。体内实验采用2个月大SP级雌性SD大鼠共18只，体重为200g，置于SP级动物实验室饲养。实验分三组：CYP17干扰组、NS对照组、空白对照组，平均每组6只大鼠。将慢病毒卵巢被膜下注射至大鼠双侧卵巢，观察GFP荧光并采用qRT-PCR检测GFP在卵巢组织中的感染效率。提取大鼠卵巢组织总RNA用于CYP17mRNA丰度的检测，收集血清用于卵巢甾体类激素的测定。　　 结果：所构建的3条慢病毒CYP17 shRNA对CYP17基因均有不同程度地沉默作用。由于慢病毒CYP17shRNA2＃作用最稳定，最终选取该条慢病毒shRNA用于整体动物实验。通过大鼠卵巢被膜下注射慢病毒CYP17 shRNA2＃2周后，将卵巢组织制作冰冻切片，荧光镜下观察可见明显的GFP荧光。GFP qRT-PCR显示慢病毒注射组的GFP mRNA水平显著增高，其相对表达水平是空白对照组的7.42倍。通过上述实验证卵巢被膜下注射的慢病毒已成功感染至卵巢组织。同时，CYP17 qRT-PCR显示RNA干扰组的CYP17 mRNA丰度显著降低，平均抑制率达61％。激素测定结果显示，RNA干扰组的雄烯二酮、17羟孕酮、睾酮均有一定程度地降低，另外孕酮水平也有下降且差异有显著性。　　 结论：本研究首次证明采用RNA干扰技术沉默CYP17基因能够一定程度地抑制卵巢雄激素的合成，这不仅为治疗PCOS等高雄激素疾病提供了新的思路，并且为RNA干扰技术在内分泌代谢疾病的运用提供了实例。但是RNA干扰对CYP17基因体内沉默的剂量效应关系以及对其它卵巢甾体类激素代谢的综合影响仍需进一步的研究。