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受体样蛋白激酶(Receptor-like Kinase,RLK)是一类广泛存在于植物中的庞大膜蛋白家族。它能通过胞外结构域识别外界信号分子,经过胞内结构域激活将信号传递到下游。RLK的这种结构特征使它在植物与外界环境的互作以及植物细胞与细胞之间的信号转导过程中发挥重要作用,从而广泛参与植物自身的多种生长发育调控和对外界环境条件的应答过程。小麦叶锈病相关受体样蛋白激酶基因(LRK10)首先分离于单子叶植物小麦。前人研究表明,LRK10胞外域不与任何已知蛋白同源,是植物中一类新型的RLK基因;LRK10属于一个大的基因家族,其同源基因广泛分布于小麦、大麦、燕麦等物种,为单子叶植物所特有;在小麦中,LRK10与抗病基因Lr10共分离,且在抗叶锈、条锈和白粉病的小麦近等基因系中均存在多态性。然而,迄今为止,LRK10参与小麦对锈病的抗性过程的直接功能证据仍然缺乏,其生化活性证据也未见报道。我们在研究普通小麦品种水源11和条锈病原菌非亲和性互作时分离到了LRK10的同源片段,命名为TaRLK。在此基础上,本研究对水源11中的TaRLK基因家族开展了一系列研究,包括基因分离、基因结构特征和表达模式分析、染色体和亚细胞定位、生化活性和遗传学功能等,获得了以下主要结果。
1、从普通小麦品种水源11中分离了5个TaRLK基因的DNA序列,其中TaRLK1、2和3获得了相应cDNA,而TaRLK4和5未检测到相应cDNA,氨基酸序列比对表明,TaRLK具有典型的RLK结构特征,由信号肽、胞外域、跨膜域和胞内丝/苏氨酸激酶结构域组成。TaRLK胞外域为一新型结构域,含有高度保守的14个Cys,2个N糖基化位点。此外,在第一个糖基化位点后紧接着一个可变的丙/丝氨酸串联重复单位。TaRLK在水源11中为一个多拷贝基因家族,其中TaRLK1和3定位于染色体1B,TaRLK2定位于染色体1D。进化分析表明,TaRLK和WLRK属于同一个RLK基因家族,它们可进一步划分为A亚组和S亚组。
2、分离TaRLK2和3的5端上游序列,对其进行顺式元件预测,发现其中存在大量高拷贝的光、激素、干旱和伤害等逆境条件调节的调控序列。进一步半定量RT-PCR研究表明,TaRLK主要在水源11叶片中表达,在茎中表达较弱,在根和穗中未检测到转录本。TaRLK转录本受条锈菌小种CYR17、CYR30或Su-1诱导上调,但Su-1诱导的亲和性互作对于CYR17或CYR30诱导的非亲和性互作来说,TaRLK的转录本诱导强度和时间明显较弱和滞后。TaRLK的转录依赖于光并受光调节。此外,非生物性环境胁迫如干旱、伤害和细胞凋亡诱导剂也能诱导TaRLK的转录本上调。
3、利用小麦表皮细胞和洋葱表皮细胞瞬时表达系统研究表明,TaRLK3定位于植物细胞质膜,其准确的质膜定位需要信号肽、胞外域和跨膜域的同时存在,而不依赖于胞内激酶域。
4、利用大肠杆菌体外表达组氨酸标签的TaRLK3胞内激酶域融合蛋白,分离纯化后进行体外生化实验,结果表明TaRLK3为一有功能活性的蛋白,其自身磷酸化依赖于Mn2+或Ca2+。
5、以水源11 TaPDS做为标记基因,建立了基于大麦条纹花叶病毒(BSMV)的小麦病毒诱导的基因沉默(VIGS)系统。利用该系统分别沉默了TaRLK1、2、和3单个基因或整个基因家族,然后接种条锈菌小种CYR17,结果表明它们均可使水源11丧失对条锈菌的过敏反应(HR)。但单基因沉默的表型明显弱于整个基因家族或TaHSP90的沉默。证明TaRLK基因参与了水源11对条锈病的抗性反应,并且家族各成员在抗病过程中有协同作用。