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酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是由于长期大量饮酒所致的肝脏疾病,主要表现为肝细胞不同程度的损伤,按病程进展分为酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化,最终可导致肝细胞广泛坏死,发生肝功能衰竭。酒精性肝纤维化是长期酒精刺激下肝脏组织以细胞外基质(extracellular matrix,ECM)增生为特征的病程,是 ALD进程的中心环节,有效治疗酒精性肝纤维化可以阻断或延缓慢性 ALD向酒精性肝硬化发展,然而目前临床尚未有能有效防治酒精性肝纤维化的理想药物。 咖啡因(caffeine)是日常饮料咖啡、茶叶中的主要成分。饮用含有 caffeine的饮料已经遍及全球,在传统观念里,饮用太多含caffeine的饮料似乎对健康无益,但近年来多项研究报道饮用以 caffeine为基础的饮料能够降低患肝脏疾病的概率,但其作用机理尚未完全阐明。那么caffeine的摄入是否也会影响到ALD进程的中心环节酒精性肝纤维化以及其可能的作用机制是什么?本实验在参考国内外相关文献的基础上,首先采用酒精浓度逐渐递增法,每日两次灌胃连续12w,成功建立了酒精性肝纤维化的大鼠模型,并在此基础上通过乙醛刺激大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)建立了酒精性肝纤维化的体外模型,观察低摄入量caffeine对大鼠酒精性肝纤维化的防治作用以及其对乙醛刺激的大鼠HSC-T6的增殖、凋亡、细胞周期的影响及部分作用机制。主要内容概括如下: 1.Caffeine对大鼠酒精性肝纤维化的防治作用： 采用酒精浓度递增法每天早晚两次灌胃,连续12w制备大鼠酒精性肝纤维化模型,给药组同时灌服不同剂量caffeine(5,10,20mg/kg)。第8w和第12w末,用药组大鼠血清酶学指标丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、透明质酸(hyaluronic acid,HA)、层粘连蛋白(laminin,LN)、Ⅲ型前胶原(Procollagen Ⅲ,PⅢNP)、Ⅳ型前胶原肽(Procollagen Ⅳ,CⅣ)较模型组显著降低(P＜0.01);HE染色和天狼猩红染色表明8w末模型组大鼠肝组织出现炎细胞浸润和大小不等的脂肪滴,部分肝小叶可见坏死,汇管区边缘有红色胶原纤维包绕,12w末模型组大鼠肝组织中坏死区内大量炎细胞浸润,汇管区有明显红色胶原纤维增生并延伸至肝小叶内,caffeine高剂量组炎性浸润程度较轻,结缔组织增生减少,纤维间隔变窄,肝组织结构趋于正常。免疫组化检测显示模型组大鼠肝组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth mucle actin,α-SMA)较正常组表达上调,caffeine用药组大鼠肝组织中α-SMA表达较模型组降低同时伴随着肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis–related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)的两种受体DR4(death receptor4)、DR5(death receptor5)表达上调。以上结果表明caffeine对大鼠酒精性肝纤维化有防治作用,其机制可能是caffeine能够上调DR4、DR5的表达而减少α-SMA的生成,从而缓解酒精性肝纤维化。 2. Caffeine对乙醛刺激的大鼠HSC-T6增殖、凋亡的影响及部分作用机制： 采用200μmol·L-1的乙醛刺激caffeine预处理1h后的大鼠HSC-T6,分别于24h,48h,72h用四甲基偶氮唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-thiazolyl)-2,5-,MTT]法检测HSC-T6增殖情况。结果显示,caffeine对乙醛刺激的HSC增殖具有抑制作用,且表现出一定的浓度和时间依赖性,24、48、72h的半效抑制浓度(50％inhibiting concentration,IC50)分别为21.404、3.332、1.784 mmol·L-1。流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测caffeine作用于乙醛刺激的HSC-T648h后的细胞凋亡及细胞周期变化情况,与模型组相比,凋亡率显著增高,G0/G1期细胞增加,S期细胞减少,G2/M期细胞减少。提取乙醛刺激的HSC-T6细胞总RNA,RT-PCR结果显示,与模型组相比,caffeine组α-SMA、Ⅰ型前胶原(Procollagen Ⅰ,PⅠ)、Ⅲ型前胶原(Procollagen Ⅲ,PⅢNP)的mRNA表达减少,TRAIL受体DR4、DR5的mRNA表达增加。以上结果表明caffeine能够抑制乙醛刺激的大鼠HSC-T6的增殖,其机制可能与上调HSC-T6中DR4、DR5的表达有关。该实验为caffeine应用于酒精性肝纤维化治疗提供了一定的体外实验基础,为评价、筛选有效治疗酒精性肝纤维化的药物提供了新思路。