普那霉素是由始旋链霉菌产生的一种链阳性菌素类抗生素，包含普那霉素Ⅰ(PⅠ)与普那霉素Ⅱ(PⅡ)两种结构完全不同的组分，其衍生物已广泛用于治疗多种耐药性病原菌引发的感染。由于抗生素的不合理使用甚至滥用，耐药菌感染十分普遍。因此，普那霉素等抗耐药菌抗生素的市场前景非常广阔。然而，国内普那霉素产生菌的发酵单位低，一直未能实现产业化。本论文以前期诱变筛选获得的高产菌HCCB10218为出发菌，采用组合代谢工程策略（包括途径特异性调控网络重塑与基因簇扩增），以及添加大孔吸附树脂原位分离普那霉素，显著提升了PⅡ的发酵水平。在研究过程中，建立了三种高效的合成生物学使能技术分别用于基因簇的体外组装、高效编辑与多拷贝染色体整合，为抗生素高产菌株的分子育种提供了通用的技术平台。此外，基于多拷贝扩增的理念，还构建了一系列优秀的天蓝色链霉菌异源表达宿主，有望加快放线菌来源的新化合物挖掘与组合生物合成研究。本论文的研究工作主要包括以下4个方面:　　(1)普那霉素途径特异性调控网络的重塑:普那霉素合成基因簇内部含有7个调控基因，分别编码PapR1-R6与SpbR，它们形成一个复杂、严谨的级联调控网络，协同参与普那霉素合成的分子调控。为了构建PⅡ高产菌株，本研究首先对这些调控基因进行了系统改造。其中，papR3或papR5（编码TetR家族调控因子）的缺失显著促进了PⅡ的合成（从185至300mg/L左右）。而过表达papR4（编码SARP家族调控蛋白）或（和）papR6（编码孤立应答调控蛋白），PⅡ产量也明显增加（最高至282mg/L）。随后，对上述正、负调控基因进行了组合改造，工程菌ΔpapR3+R4R6和ΔpapR5+R4R6的PⅡ产量分别达到368与325mg/L，相比出发菌HCCB10218提高99％与75％。更为重要的是，途经特异性调控网络的重塑为下一步PⅡ合成基因簇多拷贝整合提供了更为优良的表达宿主。　　(2)运用基因簇扩增策略构建PⅡ高产菌株及相关使能技术的开发:由于PⅡ合成基因簇在染色体中离散分布，难以通过常规的基因簇克隆方法直接获得。本研究中，建立了一种适用于高GC含量DNA大片段体外组装的改进型Gibson等温一步法。改进内容包括:1）在载体两端引入通用的、富含AT的接头，以降低因放线菌DNA高GC含量的特点引起的载体高频自连;2）在接头两侧引入交错酶切位点以实现大尺度DNA片段的等级化无缝拼接。改进方法的DNA组装效率显著提升，达到20-40％（经典方法仅为0-2.5％）。采用三级组装模式，在体外成功拼接了PⅡ合成基因簇（位于质粒BAC-F1F15中），并对其进行了测序、定点修复与功能互补验证。将BAC-F1F15导入上述4株调控网络优化后的宿主细胞ΔpapR3、ΔpapR5、ΔpapR3+R4R6与ΔpapR5+R4R6(SBJ1000)中，获得4株均额外含有1个PⅡ合成基因簇拷贝的工程菌。其中，ΔpapR5+R4R6/BAC-F1F15(SBJ1001)的PⅡ产量最高(达到462mg/L)，相比出发菌株提升1.5倍。通过添加树脂HB60原位分离普那霉素，以减弱终产物的毒害效应及对自身合成的反馈抑制，SBJ1001的PⅡ产量在摇瓶与5L发酵罐中均达到1.1g/L，相比出发菌提升5倍左右。本研究中所采用的组合代谢工程策略简单、有效，可广泛用于其他工业放线菌的遗传改造。　　为进一步提升PⅡ产量，基于“一个整合酶-多个attB位点”的理念，建立了一种基因簇扩增新方法MSGE。该方法的主要原理是在删减非目标基因簇的同时将外源attB位点插入染色体中，进而通过一步接合转移实现目标基因簇多拷贝整合。采用ΦC31位点特异性重组系统，获得了含有3个PⅡ合成基因簇拷贝的工程菌SBJ1003，其PⅡ产量达到1.74g/L。在SBJ1003的基础上，采用第二套ΦBT1重组系统再次进行基因簇扩增，构建了含有5个PⅡ合成基因簇拷贝的工程菌SBJ1005，其PⅡ产量在摇瓶与5L发酵罐中最终达到2.24与2.02g/L，相对出发菌HCCB10218分别提高11.1与9.7倍。SBJ1003与SBJ1005无抗性连续传代后的发酵结果显示，采用MSGE方法构建的高产菌株遗传性状稳定，多拷贝整合的PⅡ合成基因簇不发生丢失。在此过程中，组合CRISPR/Cas9系统与Gibson等温一步法，建立了一种新的基因簇体外编辑方法CGE，高效介导了BAC-F1F15的整合/抗性元件的替换（效率为45％），进而实现了PⅡ合成基因簇的两轮整合。综上所述，PⅡ合成途径的系统改造，包括调控网络的重塑与基因簇多拷贝整合，大幅提升了PⅡ产量，促进了普那霉素在国内的产业化进程。同时，研究中所建立的基因簇多拷贝扩增与编辑方法，操作简单、通用性强，为放线菌天然产物高产菌株的分子育种提供了先进的技术手段。　　(3)运用MSGE策略构建天蓝色链霉菌高效异源表达宿主:还基于基因簇扩增的理念，开发了一系列含有多个ΦC31attB位点的天蓝色链霉菌异源表达宿主（M1246-M1546与M1252-M1552），实现了氯霉素或抗癌小分子YM-216391合成基因簇多达4个拷贝的一步高效整合，相比出发菌株M1146与M1152，其产量分别提高2与23倍，充分展现了这些底盘细胞的优越性。其次，在天蓝色链霉菌与始旋链霉菌中系统测试了MSGE介导的基因簇多拷贝整合效率，发现attB位点离散分布是获得目标基因簇高频整合的关键因素。此外，还拓展了基因簇编辑方法CGE的应用范围，完成了氯霉素与YM-216391合成基因簇的高效编辑，包括单基因缺失、点突变或启动子替换等。可以预计，这些优秀的底盘细胞与CGE编辑方法的组合使用，将推动放线菌新化合物挖掘与途径解析。　　(4)天蓝色链霉菌中新型双组分系统GluR-K的功能鉴定:论文最后一章，在天蓝色链霉菌中鉴定了一个差异调控抗生素合成的双组分系统GluR-K(SCO5778/5779)。有趣的是，该双组分系统只有在含有谷氨酸的基本培养基条件下才被激活。研究发现，GluR-K可直接感应谷氨酸信号，进而参与抗生素的合成以及谷氨酸转运子编码基因gluABCD的转录调控。在以高浓度(75mM)谷氨酸为唯一氮源的基本培养基中，GluR-K不仅可以激活gluABCD的表达，进而促进谷氨酸向胞内大量转运，同时还参与放线紫红素、CPK等抗生素合成的差异调控。而在低浓度(10mM)谷氨酸条件下，GluR-K仅参与抗生素的合成，其具体调控机制还有待进一步解析。生物信息学分析显示，基因组中相邻的谷氨酸感应（GluR-K）及转运(GluABCD)模块在放线菌中广泛存在，具有普适性。这些研究结果丰富了人们对放线菌中参与谷氨酸感应及转运的信号传导通路的现有认知。