目的流感是流感病毒引起的急性呼吸道传染病,好发于冬春季节,由于流感病毒极易产生变异,很难制备有效的疫苗,而针对流感病毒感染的西药既有较强的毒副作用,又容易诱导病毒产生耐药性。这种现状下,在我国的中医药宝库中寻找有效药物、创造新型药剂来防治流感就成为一项很有意义的研究工作。本实验采用流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM1)感染小鼠作为模型,观察疏风宣肺方(主要药物金银花、连翘、牛蒡子、蝉蜕、荆芥等)和解表清里方(主要药物炙麻黄、生石膏、黄芩、杏仁、生甘草等)对FM1感染小鼠的治疗作用及其对免疫功能的影响。同时,以天然免疫中重要的模式识别受体TLR (Toll样受体)为切入点,探讨其抗病毒作用及免疫调节作用的分子机制；并观察疏风宣肺和解表清里方药对流感病毒性肺炎小鼠肺组织CD4+辅助性T淋巴细胞1/2(TH1/2)平衡的调控作用。基因芯片技术在研究药物对机体免疫系统的调节,寻找药物靶向方面应用广泛。本实验运用基因芯片技术,研究小鼠基因谱的差异基因,并力求进一步找到两种方药发挥抗流感作用的相关分子,为两种方药的临床应用提供明确的生物学基础和实验依据。方法1、实验一观察流感病毒感染小鼠肺组织病理形态学变化。选择SPF级雄性ICR小鼠81只,按随机数字表法分为对照组、模型组、达菲组以及疏风宣肺方高、中、低剂量组和解表清里方高、中、低剂量组9组,每组9只。采用流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM1)滴鼻感染小鼠建立流感病毒性肺炎模型,对照组以0.05ml生理盐水滴鼻。于病毒感染后2h,对照组、模型组灌胃蒸馏水；达菲组给予达菲2.5g·m1-1·d-1；其余6组分别灌服疏风宣肺抗流感方药(主要药物金银花、连翘、牛蒡子、蝉蜕、荆芥等)高、中、低剂量(3.762、1.881、0.941g·kg-1·d-1)和解表清里抗流感方药(主要药物炙麻黄、生石膏、黄芩、杏仁、生甘草等)高、中、低剂量(4.368、2.184、1.092g·kg-1·d-1);均每日1次,每次0.2ml,连用4d。观察各组小鼠肺组织切片病理形态变化。2、实验二两种方药对流感病毒性肺炎小鼠肺组织全基因表达谱的影响。选择SPF级雄性ICR小鼠108只,按随机数字表法分为对照组、模型组、达菲组以及疏风宣肺方高、中、低剂量组和解表清里方高、中、低剂量组9组,每组12只。采用流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM1)滴鼻感染小鼠建立流感病毒性肺炎模型,对照组以0.05ml生理盐水滴鼻。于病毒感染后2h,对照组、模型组灌胃蒸馏水；达菲组给予达菲2.5g·ml-1·d-1;其余6组分别灌服疏风宣肺抗流感方高、中、低剂量(3.762、1.881、0.941g·kg-1·d-1)和解表清里抗流感方高、中、低剂量(4.368、2.184、1.092g·kg-1·d-1);均每日1次,每次0.2ml,连用4d。提取RNA,应用基因芯片技术检测各组引起的小鼠全基因组基因表达谱的改变,从中筛选出在统计学上有显著差异的基因改变。3、实验三两种方药对流感病毒性肺炎小鼠TLR通路相关基因的影响。制备小鼠甲型流感病毒性肺炎模型,随机分为正常组、模型组、达菲组、疏风宣肺方高、中、低剂量组,解表清里方高、中、低剂量组。提取各组总RNA,采用基因组芯片筛选出与TLR通路相关的差异表达基因,计算探针信号在各组与模型组的强度比值。4、实验四两种方药对TLR通路的影响。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)测定肺组织TLR7、MyD88、NF-κ、BmRNA表达,采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)测定肺组织TLR7、MyD88、NF-κB蛋白表达水平。5、实验五两种方药对流感病毒性肺炎小鼠TH1和TH2细胞平衡调节的研究。采用实时荧光定量聚合酶链反应(PT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blotting)分别测定各组肺组织Y-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4) mRNA以及蛋白表达水平。结果1、小鼠肺脏大体观察：正常对照组小鼠肺脏呈淡粉色,含气、无实变区；模型组肺脏可见成片的、红褐色实变区。各治疗组实变区较模型组小。病理切片光镜下观察：正常对照组肺小鼠泡、肺泡囊、肺泡管、肺泡隔形态完整,肺泡壁菲薄,无炎性细胞；模型组肺泡壁广泛单核细胞、淋巴细胞及中性粒细胞浸润,肺泡壁增宽,病灶范围大,数量多。各治疗组其病变范围及程度均较模型组减轻。达菲组和两种方药中、小剂量组肺组织形态结构较为完整,肺泡腔内少量浆液性渗出,有少量淋巴细胞和单核细胞浸润；两种方药大剂量组肺组织间可见许多炎性细胞渗出。2、与模型组相比,对疏风宣肺方和解表清里方治疗组的差异基因进行GO term节点富集分析,按照P<0.05,且涉及的基因数分别为不小于70和40取GO节点,疏风宣肺方涉及免疫学方面的分子功能为：浆膜、胞内信号级联放大效应、免疫应答、细胞增生的调节、细胞凋亡及防御反应等。解表清里方涉及免疫学方面的分子功能为：浆膜、胞外区、免疫应答、细胞增生的调节、胞内信号级联放大效应、防御反应等。在KEGG数据库中,对差异基因涉及的代谢通路进行进一步分析,按照P<0.05,且涉及的基因数不小于3进行筛选,疏风宣肺方主要调节的代谢途径有：细胞因子与细胞因子受体的相互作用、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、肿瘤信号通路、趋化因子信号通路、toll样受体信号通路、信号转导及转录激活因子途径及自然杀伤细胞介导的细胞毒作用等。解表清里方主要调节的代谢途径有：细胞因子与细胞因子受体的相互作用、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、肿瘤信号通路、趋化因子信号通路、肌动蛋白细胞骨架调节、toll样受体信号通路、信号转导及转录激活因子途径及黏着斑等。代谢途径P值较小,差异显著,富集程度较高。3、与正常组比较,模型组差异表达基因TLR7、MYD88、CCL5、IFNB1、IL6、IL12a、 NFKBIA、IKBKB明显上调。疏风宣肺中、低剂量组和解表清里中剂量组对差异表达基因TLR3、TLR7、MYD88、CCL5、IFNB1、IL6、IL12a、NFKBIA、IKBKB明显下调。疏风宣肺方治疗效果比解表清里方好。4、与正常组比较,模型组TLR7、MyD88、NF-κBmRNA及蛋白表达升高(P<0.01)；与模型组比较,达菲组,疏风宣肺方高、中、低剂量组,解表清里方中剂量组TLR7. MyD88、NF-κBmRNA及蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)5、与对照组比较,模型组IFN-γ mRNA及蛋白表达均明显降低,IL-4mRNA及蛋白表达均明显升高(均P<0.05)。与模型组比较,达菲组、疏风宣肺方中、低剂量组和解表清里方中剂量组IFN-γ mRNA及蛋白表达均升高(P<0.01)；疏风宣肺方中、低剂量组IL-4mRNA及蛋白表达降低(P<0.05)结论1、从病理切片直观可知疏风宣肺方和解表清里方的中、低剂量组能改善流感病毒感染小鼠的肺组织病理损伤,对流感病毒感染小鼠有一定的治疗作用。2、疏风宣肺方作用涉及免疫学方面的分子功能为：浆膜、胞内信号级联放大效应、免疫应答、细胞增生的调节、细胞凋亡及防御反应等；主要调节的代谢途径有：细胞因子与细胞因子受体的相互作用、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、肿瘤信号通路、趋化因子信号通路、toll样受体信号通路、信号转导及转录激活因子途径及自然杀伤细胞介导的细胞毒作用等。解表清里方涉及免疫学方面的分子功能为：浆膜、胞外区、免疫应答、细胞增生的调节、胞内信号级联放大效应、防御反应等；主要调节的代谢途径有：细胞因子与细胞因子受体的相互作用、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、肿瘤信号通路、趋化因子信号通路、肌动蛋白细胞骨架调节、toll样受体信号通路、信号转导及转录激活因子途径及黏着斑等。3、疏风宣肺中、低剂量组和解表清里中剂量组明显下调TLR通路中差异表达基因TLR3、TLR7、MYD88、CCL5、IFNB1、IL6、IL12a、NFKBIA, IKBKB.4、疏风宣肺方高、中、低剂量和解表清里中剂量能通过调节MyD88依赖的TLR7信号传导通路下调NF-κB活性,发挥抗流感病毒的作用。疏风宣肺方效果优于解表清里方。5、疏风宣肺方通过升高IFN-γ水平,降低IL-4水平,纠正TH1、TH2细胞的平衡,减轻肺组织免疫病理损伤,以中低剂量组为优。