研究目的先天性唇腭裂（orofacial cleft, OFC）是口腔临床最常见的先天发育缺陷,其发病率大约为千分之一至千分之二。唇腭裂患者都存在面部美观、功能甚至心理等一系列问题,这些患者往往需要序列治疗,包括外科手术、口腔正畸、语言训练及心理治疗等,由此产生了一系列家庭及社会问题。因此,研究唇腭裂的病因机制,不仅有助于从根本上理解唇腭裂的发生和发展过程,也能给临床的病因诊断及遗传咨询带来巨大的帮助,有着很重大的社会意义。根据是否合并其他器官的改变,唇腭裂可分为综合征唇腭裂（syndromic cleft lip with or without cleft palate, SCL/P）及非综合征性唇腭裂（non-syndromic cleft lip with or without cleft palate, NSCL/P）两种。非综合征性唇腭裂占唇腭裂总数的70%,包括单纯唇裂（cleft lip, CL）、单纯腭裂（cleft palate, CP）、唇裂伴腭裂（cleft lip and palate, CLP）。综合征唇腭裂的致病基因往往比较明确,大多为单基因遗传病,而非综合征唇腭裂的致病因素相对复杂,研究非综合征唇腭裂可以更好的理解唇腭裂的发病机制。本研究是对山东地区非综合征唇腭裂患者进行收集,采样,并从外周血白细胞中提取基因组DNA,利用分子遗传学技术,对临床收集的非综合征唇腭裂患者进行MSXl基因和IRF6基因突变检测,寻找MSXl基因和IRF6基因突变携带者,进行突变基因型的生物信息学分析,探索MSXl基因和IRF6基因突变与非综合征唇腭裂的关系。研究方法首先进行病例和对照人群的资料和DNA收集。收集临床病例标准：2013-2015年,在山东大学第二医院进行唇腭裂治疗的患者,选择符合以下条件者：1)唇腭裂患者；2)不伴发其他系统器官畸形。在患者或监护人知情同意的基础上,纳入作为研究对象。收集正常对照选取标准：1)无唇腭裂病史；2)其他器官无发育异常。在本人或监护人知情同意的基础上,纳入本研究。实验内容包括：1)抽取患者及部分家系成员的外周静脉血2m1/人,另抽取正常人外周静脉血208份。EDTA抗凝,-70℃保存备用。采用全血基因组DNA试剂盒提取基因组DNA；2)聚合酶链式反应扩增MSXl和IRF6基因的全部外显子区域,将产物直接进行测序；3)从NCBI-Homologene数据库中提取人MSX1和IRF6蛋白的同源序列,将人MSX1蛋白（NP 002439.2）和9种脊椎动物的Msx1蛋白（NP₀01182191.1, XP₀01118871.2, XP₅45946.2, NP₇77223.1, NP₀34965.2, NP₁12321.1, NP₉90819.1, NP₅71348.1 NP₀01032329.1）进行比对,从NCBI-Homologene数据库中提取人IRF6蛋白的同源序列。将人IRF6蛋白（NP 006138.1）和9种脊椎动物的Irf6蛋白（XP₅14168.2, XP₀01110321.1, XP₀05622392.1, NP₀01070402.1, NP₀58547.2, NP₀01102329.1, XP₄17990.4, NP₉56892.1和NP 001025493.1）进行比对,利用ClustalW2软件分析氨基酸的保守性；4)从NCB I-Homologene数据库中提取人MSX1蛋白的同源序列,运用ClustalX2.0.12程序对这些蛋白序列进行了多重比较,并且利用PsiPred 3.0程序对人MSX1的2D结构进行预测；从NCBI-Homologene数据库中提取人IRF6蛋白的同源序列。运用ClustalX2.0.12程序对这些蛋白序列进行了多重比较,并且并且在线网站PredictProtein （http://www.predictprotein）的2D结构进行预测：5)运用ClustalX2.0.12程序对这些蛋白序列进行了多重比较。利用在线网站（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）分析MSX1蛋白序列和IRF6蛋白保守性；6)利用在线软件Phyre （www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre/）根据氨基酸序列一级保守性和已知蛋白结构预测野生型和突变型IRF6蛋白的三维结构,并使用PyMOL软件输出图像。研究结果在54例非综合征性唇腭裂患儿中完成了MSX1和IRF6基因突变筛查。在编号13#患者中发现了MSX1基因第二外显子上的一个错义突变（c.492C>G; p.Cys164Trp）.先证者性别男,年龄1岁,单纯型唇裂,父母表型正常,没有唇腭裂家族史。在发现患儿存在MSX1基因突变后我们对父母追加了MSX1突变检测,父母基因型与正常人一致。检测到的突变位于cDNA序列的492位,编码的氨基酸为半胱氨酸（Cys）,患者该位点存在一个杂合的点突变,碱基由C变为G,编码的氨基酸变成色氨酸（Trp）。将人MSX1蛋白（NP 002439.2）和9种脊椎动物（P.troglodytes, M.mulatta、 C.lupus, B.taurus, M.musculus, R.norvegicus, G.gallus, D.rerio和X.tropicalis）的Msx1蛋白（NP₀01182191.1, XP₀01118871.2, XP₅45946.2, NP₇77223.1, NP₀34965.2, NP₁2321.1, NP₉90819.1, NP₅71348.1和NP₀01032329.1）进行比对,结果显示164位点的氨基酸Cys在生物进化过程中高度保守,提示该位点的突变可能导致氨基酸功能的改变。蛋白质二维结构分析显示,164Cys在为高度保守残基,位于保守的2D片段。这个残基的突变会影响人类MSX1蛋白质的功能。其中,p.Cys164Trp这一突变由半胱氨酸替换为色氨酸,半胱氨酸为一含有侧链的羟基氨基酸,这一突变可能会消除164Cys与邻近残基的静电作用,由带电残基转变为中性残基,带电性质的改变会严重影响蛋白的活性；另外半胱氨酸为亲水基团而色氨酸是疏水基团,亲疏水性质的改变会影响蛋白的活性。Weblogo分析显示在MSX1蛋白第164位堆栈只有C（Cys）,表示该位点高度保守,提示我们该位点的突变可能导致蛋白质功能的改变。在54例非综合征性唇腭裂患儿中完成了IRF6基因测序,在一例散发性患儿中发现了IRF6基因的一个无义突变。研究编号40#,性别男,年龄1.5岁,单纯型腭裂。患儿是散发病例,没有获得亲生父母的DNA,家族史不详。测序结果与正常人基因组IRF6序列和对照组序列进行比对,显示IRF6基因第9外显子上的一个无义突变,可以导致IRF6蛋白在440位置终止（c.1320C>G；p.Tyr440X）.将人IRF6蛋白（NP₀06138.1）和9种脊椎动物的（P.troglodytes, M.mulatta, C.lupus. B.taurus, M.musculus, R.norvegicus, G.gallus, D.rerio和X.tropicalis）的Irf6蛋白（XP₅14168.2, XP₀01110321.1, XP₀05622392.1, NP₀01070402.1, NP₀58547.2, NP₀01102329.1 XP₄17990.4, NP₉56892.1和NP₀01025493.1）进行比对,结果显示440位点的氨基酸之后的序列高度保守,提示该改变对蛋白质功能影响较大。蛋白质二级结构预测显示,截短的蛋白质二级结构发生改变,提示突变以后对蛋白质功能有一定影响。Weblogo分析显示在IRF6蛋白第440位堆栈只有Y（Tyr）,表示该位点高度保守,提示我们该位点的突变可能导致蛋白质功能的改变。蛋白三维结构预测显示截短的突变型IRF6蛋白三维结构发生改变,并形成了α-螺旋减少,对蛋白质功能造成了影响。研究结论本研究针对临床收集到山东地区的先天性非综合征性唇腭裂病例,主要从致病基因的突变检测入手,进行分子病因学研究,以探索基因型和唇腭裂的相关性。本研究的第一部分通过对非综合征性唇腭裂的MSXl基因的突变检测和生物信息学分析,研究患者的致病基因和突变类型,以明确MSX1基因突变与临床表型之间的相关性。本研究的第二部分通过对非综合征性唇腭裂的IRF6基因的突变检测和生物信息学分析,研究患者的致病基因和突变类型,以明确IRF6基因突变与临床表型之间的相关性。以上研究得到如下结论：1、通过对临床收集的非综合征性唇腭裂患者MSX1基因筛查检测,发现了一个可能导致非综合征性唇腭裂的错义突变。（1）.在编号13#患者中发现了MSXl基因第二外显子上的一个错义突变（c.492>G; p.Cysl64Trp）。检测到的突变位于cDNA序列的492位,编码的氨基酸为半胱氨酸（Cys）,患者该位点存在一个杂合的点突变,碱基由C变为G,编码的氨基酸变成色氨酸（Trp）。先证者的父母不存在此突变类型,该突变为新生突变。目前国内并没有关于MSX1突变可以导致非综合征唇腭裂的发生报道,本研究是首次在中国人群非综合征性唇腭裂患者中发现了一个MSXl基因突变。（2）.对该位点进行生物信息学分析,显示该位点在生物进化过程中高度保守,突变可能影响蛋白质功能。将人MSX1蛋白和9种脊椎动物的Msx1蛋白进行比对,结果显示164位点的氨基酸Cys在生物进化过程中高度保守,Weblogo分析显示在MSX1蛋白第164位堆栈只有C（Cys）,表示该位点高度保守。蛋白质二维结构分析显示,164Cys在为高度保守残基,位于保守的2D片段。这个残基的突变会影响人类MSX1蛋白质的功能。以上研究都提示我们该位点的突变可能导致蛋白质功能的改变。2、通过对临床收集的非综合征性唇腭裂患者IRF6基因筛查检测,发现了一个可能导致非综合征性唇腭裂的无义突变。（1）.在54例非综合征患儿中完成了IRF6基因测序,在一例散发性患儿中发现了IRF6基因的一个无义突变。患儿是散发病例,没有获得亲生父母的DNA,家族史不详。测序结果与正常人基因组IRF6序列和对照组序列进行比对,显示IRF6基因第9外显子上的一个无义突变,可以导致IRF6蛋白在440位置终止（c.1320C>G；p.Tyr440X）。目前国内外已经有关于IRF6突变可以导致非综合征唇腭裂的报道,本研究首次报道了IRF6上的一个新的突变,有助于扩大IRF6突变的表达谱,为深入理解IRF6基因与非综合征性唇腭裂的关系打下了一定基础。（2）.生物信息学分析显示,该突变对蛋白质功能及结构都有较大影响。将人IRF6蛋白和9种脊椎动物的的Irf6蛋白进行比对并进行Weblogo分析,结果显示440位点的氨基酸之后的序列高度保守,蛋白质二维和三维结构分析也显示突变蛋白截短后功能有一定改变。研究意义非综合征性唇腭裂的致病基因一直是该领域研究的热点和难点。本研究通过对临床收集到非综合征性唇腭裂病例进行致病基因的突变筛查,在中国人群中检测到非综合征性唇腭裂致病基因和新突变类型,并对突变蛋白进行了生物信息学分析,进一步验证了突变蛋白和非综合征性唇腭裂的联系。本研究在首次发现了MSXl和IRF6基因上的两个新的突变类型,并进行了生物信息学分析,不仅可以加深对此类疾病的认识,而且有利于更加全面深入地了解相关致病基因的结构与功能,进而为研究非综合征性唇腭裂的分子机制提供线索,提高临床预防和治疗此类疾病的水平。