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伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的可感染多种哺乳动物的急性传染病。猪是PRV的自然宿主,感染可造成怀孕母猪发生流产、死胎、木乃伊胎,新生仔猪急性死亡。PRV属于疱疹病毒科,具有疱疹病毒粒子的典型结构,其中,被膜层是一个复杂的蛋白网络,位于衣壳和囊膜之间。由UL37、UL48、UL49基因分别编码的被膜蛋白pUL37、VP16、VP22在病毒复制及装配中执行着不同的生物学功能,研究这些蛋白的功能对新的抗病毒靶点筛选具有重要意义。然而,对这些蛋白进行检测和定位的方法还没有建立起来。本研究,首先将UL49、UL48、UL37基因分别克隆到真核表达载体pCAGGS,并采用KCl染色切胶法纯化原核表达的蛋白。分别用真核质粒和纯化的蛋白作为抗原,对Balb/c小鼠进行3次免疫。通过细胞融合及单抗特性鉴定试验获得1株稳定分泌VP22蛋白单抗的杂交瘤细胞株3D6;2株稳定分泌VP16蛋白单抗的杂交瘤细胞株1D4、4B6;3株稳定分泌pUL37蛋白单抗的杂交瘤细胞株1E2、2G2、11C3。间接免疫荧光(IFA)和Western-blot试验表明,抗体株均可与相应蛋白特异性结合;经抗体亚类试剂盒鉴定,单抗亚类均为IgMκ;ELISA检测单抗的效价,1D4为1:8000,11C3为1:6000,3D6为1:3000,4B6为1:4000,1E2、2G2为1:32000。测定PRV分离株HLJ-2013的病毒滴度,并将其(0.1 MOI)接种于易感性细胞PK15,16 h后收集细胞并制备免疫标记用超薄切片。将以上实验获得的单克隆抗体进行1:50,1:100,1:200稀释作为一抗,商品化抗鼠金标抗体1:100倍稀释作为二抗,进行感染细胞内伪狂犬病毒VP22、VP16、pUL37蛋白免疫标记和电镜检测。通过对免疫电镜结果的分析,筛选出在亚细胞水平结合特异性强的单克隆抗体株:3D6、1D4、1E2,其最佳稀释比例分别为:1:100、1:100、1:200。综上所述,本研究成功制备出针对PRV被膜蛋白pUL37、VP16、VP22的单克隆抗体,为PRV结构研究提供了生物材料;利用单克隆抗体建立了在PRV感染细胞内pUL37、VP16、VP22蛋白的免疫胶体金标记方法,为这几种蛋白的功能及被膜装配机制的研究提供了技术手段。