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癫痫作为神经内科常见疾病,发病机制尚不清楚,目前观点认为除遗传、环境外,突触重塑、离子通道异常、神经元细胞凋亡以及外伤、炎症等都可能是癫痫的病因。其中,以苔藓纤维出芽为基本病理改变的突触可塑性则是癫痫诸多病理生理过程共同的基础。癫痫的反复发作导致突触重塑,形成异常网络结构,这种异常的网络结构又会促使癫痫反复发作,并最终发展为难治性癫痫。miRNAs能够在转录后水平调控癫痫发生发展的多个环节,且在癫痫中也存在多种miRNAs的表达异常。本研究通过高通量测序技术对癫痫患者海马组织中miRNAs表达谱变化进行研究,筛选差异表达的miRNAs,利用生物信息学技术对这些差异表达的miRNAs进行靶基因预测,并通过双荧光素酶报告基因验证靶标关系,最后在构建的体内外模型中研究miRNA-134影响癫痫发生发展的具体作用机制,为癫痫的病因学研究和抗癫痫药物开发提供理论基础。目的:1.研究癫痫患者海马组织中miRNAs表达谱的变化,筛选在癫痫中差异表达的miRNAs并进行靶基因预测;2.体外培养大鼠原代海马神经元并神经元鉴定;构建miR-134过表达载体和CREB、SYT11、MAPT双荧光素酶报告基因载体,利用双荧光素酶报告基因系统对miR-134与CREB、SYT11、MAPT进行靶标关系验证;3.在癫痫体内外模型中过表达和干扰miR-134,研究CREB、SYT11的表达变化,分析作用机制。方法:1.通过高通量测序技术,对癫痫患者海马组织与正常颞叶脑组织中非编码小RNA进行全基因组测序,与已知数据库比对,鉴定已知miRNAs,预测新miRNAs,对miRNAs的表达量进行标准化分析,筛选差异表达的miRNAs,并利用生物信息学技术进行靶基因预测;2.利用不同胎龄的Wistar胎鼠进行原代海马神经元提取,比较不同生长密度生长时神经元的状况,并通过免疫细胞化学和免疫荧光的方法,以神经元特异性抗体MAP-2鉴定体外培养的海马神经元细胞;通过miRBase数据库设计miR-134过表达载体,通过UCSC数据库和NCBI数据库设计CREB、SYT11、MAPT双荧光素酶报告基因载体,应用双荧光素酶报告基因系统检测靶基因荧光素酶活性;3.无镁细胞外液构建癫痫细胞模型,戊四氮点燃大鼠慢性癫痫模型;根据miRBase数据库信息,设计miR-134过表达、干扰序列,以重组腺病毒为载体,感染癫痫细胞及癫痫大鼠;实时荧光定量PCR检测体内外模型中miR-134、CREB、SYT11 mRNA表达量,免疫印迹检测CREB、SYT11蛋白表达量。结果:1.经数据过滤后,癫痫组3个样本中各鉴定已知miRNAs 1206个、1196个、1202个,预测新miRNAs 48个、59个、55个;正常对照组鉴定已知miRNAs 1056个,预测新miRNAs 53个;经对表达量标准化分析后,发现在癫痫患者海马组织中,38种miRNAs表达上调,其中已知miRNAs31种,新预测miRNAs7种;17种miRNAs表达下降,其中已知miRNAs11种,新预测miRNAs6种;对差异表达的2701个miRNAs进行靶基因预测,共预测出15700个靶基因,包括CREB、SYT11、MAPT等;2.E16胎鼠海马组织所提取神经元平均纯度为96.1%,E17胎鼠海马组织所提取神经元平均纯度为95.3%,E18胎鼠海马组织所提取神经元平均纯度为94%,E19胎鼠海马组织所提取神经元平均纯度为90.6%;E16胎鼠海马组织所提取海马神经元以5×10~5/ml-2×10~6/ml密度生长于添加B27的无血清培养基中有较高的神经元纯度且能稳定生长;以MAP-2为一抗,免疫组织化学方法可观察到所提取神经元细胞中棕黄色颗粒沉积;荧光显微镜,通过免疫荧光方法可见神经元胞体和轴突呈现绿色荧光;miR-134+CREB WT组荧光值较miR-134+CREB mut组明显降低,miR-134+SYT11 WT荧光值较miR-134+SYT11mut组(结合位点1)明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);miR-134+SYT11WT组(结合位点2)与miR-134+SYT11 mut组(结合位点2)荧光值之间的差异无统计学意义(P>0.05):miR-134+MAPT WT组荧光值较miR-134+MAPT mut组荧光值之间的差异无统计学意义(P>0.05);3.在癫痫体内外模型中,miR-134的表达量下降,CREB、SYT11表达量升高,过表达miR-134,可使CREB、SYT11表达减少,干扰miR-134的表达,则使CREB、SYT11表达升高;干扰miR-134的表达可以改变神经元细胞突触形态,增加树突棘密度,增加癫痫大鼠癫痫发作的频率和程度。结论:1.癫痫患者脑组织中存在多种miRNAs表达异常,以miRNAs表达上调为主;miR-134在癫痫患者脑组织中表达下降;2.大鼠原代海马神经元细胞以5×10~5/ml-2×10~6/ml生长于添加B27的无血清培养基中有较高的神经元纯度且能稳定生长;3.CREB、SYT11是miR-134的靶基因,miR-134抑制CREB、SYT11的表达;4.在癫痫体内外模型中,miR-134通过调控突触重塑相关因子CREB、SYT11来影响癫痫的发生发展。