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甜菜黑色焦枯病毒(Beet black scorch virus, BBSV)新疆分离物(BBSV-X)与宁夏分离物(BBSV-N)在致病性上存在明显差异。以病毒RNA为模板,RT-PCR方法获得了BBSV-X全长cDNA克隆。序列分析显示,BBSV-X基因组RNA全长为3644个核苷酸(nt)。与BBSV-N相比,二者的基因组结构基本相同,全长序列核苷酸一致性高达98.9%。但在ORF2的889~975 nt之间,BBSV-X比BBSV-N间隔性多出了3个核苷酸,因而导致p82蛋白(复制酶)的部分氨基酸(285~312 aa)发生移码突变。与BBSV-N相比,p82蛋白的氨基酸序列一致性仅为95.4%。构建获得BBSV-X的侵染性cDNA克隆后,将BBSV-X复制酶中的差异区段与BBSV-N互换。体外转录物分别接种苋色藜(Chenopodium amaranticolor)和豇豆(Vigna sinensis),观察互换复制酶变异片段重组体的寄主范围及所造成的症状。由于未发现由此引起的相应变化,故认为BBSV复制酶基因变异可能与其对苋色藜和豇豆的致病性差异没有关系。 构建了35S启动子控制下的BBSV卫星RNA(sat-RNA)全长侵染性克隆,侵染性检测表明,所获得的3个克隆均有较好的侵染性。构建了BBSV-X基因组6个缺失和插入突变体,将它们的体外转录物单独或与sat-RNA一起混合接种苋色藜,初步实验结果表明,sat-RNA能增强全长BBSV-X基因组及含全长基因组的突变体对苋色藜所致的症状,但减轻CP缺失突变体的致病性。 为研究坏死病毒属(Necrovirus)新成员BBSV与其它成员间的相互关系,对Necrovirus的典型成员烟草坏死病毒(Tobacco necrosis virus, TNV)中国大豆分离物进行了较为系统的生物学、理化特性及血清学特性等方面的研究。结果表明,TNV中国大豆分离物体外非常稳定,人工接种能侵染8科29种植物,多产生局部枯斑,但系统侵染大豆和本珊烟;利用提纯的病毒,制备了高效价的特异抗血清。在血清学方面,TNV大豆分离物与柳树分离物密切相关,大豆分离物与TNV-D和BBSV无血清学关系。 根据已报道的TNV-A和TNV-D的核苷酸序列设计简并引物,以TNV中国大豆分离物基因组RNA为模板,RT-PCR扩增获得部分片段的cDNA,再根据所获序列设计特异引物进行RT-PCR扩增和3′、5′RACE,获得了TNV中国大豆分离物的全基因组序列。序列分析表明,TNV中国大豆分离物基因组RNA全长为3682nt,含有5个开放阅读框:序列比对显示,TNV中国大豆分离物与已报道的TNV-A、TNV-D和TNV-D~H的序列一致性分别为86.4%、43.7%和44.3%。根据生物学特性与全基因组的核苷酸序列,认为TNV中国大豆分离物属于TNV-A的一个新株系,命名为TNV-A~C。 分别构建了T7 RNA聚合酶启动子和35S启动子控制的TNV-A~C侵染性cDNA克隆,通过分析ORF1、ORF3、ORF4、ORF5突变体对TNV-A~C侵染和复制效率的影响,初步证明,TNV-A~c的ORF1与病毒的复制有关,ORF3、ORF4与病毒的胞间运动有关,ORF5虽不影响病毒在本珊烟的致病性,但影响病毒的长距离移动。