背景：大鼠是最早被用于科学研究的实验动物。与最为常用的模式生物小鼠相比，大鼠具有许多独特的优势，如体型更大便于实验操作、生理特征与药物反应性与人更为接近等，因而长期被更为广泛的应用于行为学、生理学和药理学以及毒性测试等实验。多种基于大鼠的疾病模型也已成功应用于心脏衰竭、高血压、糖尿病和神经退行性疾病等的研究。然而由于缺乏类似于小鼠的胚胎干细胞系(ESCs)，大鼠在实验研究中的应用受到了极大地限制。2008年，Austin Smith和Qi-long Ying研究组通过应用特殊的无血清培养系统和特定信号通路的抑制剂，成功建立了真正的具有多能性的大鼠胚胎干细胞系(rESCs)。结合大鼠在生理学和药理学试验中的良好基础，rESCs系的建立有望更广泛推进大鼠模式生物的应用。然而目前rESCs体外分化仍非常困难。　　方法：本课题首先建立了两株Dark Agouti品系的rESCs，通过碱性磷酸酶染色、未分化细胞特异性标志蛋白表达分析鉴定rESCs的未分化状态：通过畸胎瘤实验和嵌合体实验鉴定rESCs在体内发育的多能性：通过对分化条件、细胞消化方法、类胚体(EBs)形成方法等的系统筛选建立rESCs体外分化体系；通过对早期胚层分化细胞标志基因，以及心肌前体细胞和心肌细胞细胞标志基因的表达分析鉴定rESCs向三胚层和心肌细胞的分化能力；通过统计类胚体中出现自发搏动心肌细胞的比例和流式细胞仪分析鉴定rESCs向心肌细胞分化的效率：通过全细胞膜片钳(whole-cell patch clamp)记录由rESCs体外分化得到的心肌细胞(rESCMs)的电活动；用Fura-2作为Ca2+的荧光指示剂，记录rESCMs细胞浆内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的瞬间变化([Ca2+]itransients，钙瞬变)；利用药理学方法检测了rESCMs对重要的心肌细胞功能调控信号的反应性。　　结果：研究结果显示未分化的两株rESCs都表现出典型的胚胎干细胞形态，并表达主要的未分化胚胎干细胞的特异性标志物。畸胎瘤实验和嵌合体实验结果都证明rESCs具有在体内发育的多能性。为了鉴定rESCs在体外的分化潜能，我们尝试使用诱导小鼠胚胎干细胞(mESCs)形成类胚体的方法诱导rESCs进行体外分化。结果发现经典的适用于mESCs形成类胚体的方法和培养条件并不适用于rESCs，在该条件下rESCs表现出明显的不适应并迅速的死亡，无法形成正常的类胚体。对分化条件、细胞消化方法、类胚体形成方法等进行了系统的摸索和筛选，结果发现通过结合使用条件性培养基(Conditioned Mediam)、MEK激酶的抑制剂PD0325901、糖原合成酶激酶3D(GSK3β)的抑制剂CHIR99021以及Rho激酶的抑制剂Y27632，rESCs可以在体外非常高效的形成类似于mESCs的类胚体。进一步对早期胚层分化细胞标志基因的鉴定发现rESCs可通过该体系分化至至内、中、外三胚层。通过对分化条件的进一步优化，成功获得了具有典型大鼠胚胎心肌细胞形态和肌丝结构特征的心肌细胞；该分化系统时序表达中胚层、心肌前体细胞和心肌细胞的标志性基因。通过对rESCMs的电活动和钙活动进行分析，结果发现分化的rESCMs包括了三种主要的心肌细胞类型：心室肌细胞、心房肌细胞以及窦房结细胞，且分化的心肌细胞对β-肾上腺素受体激动剂Isoproterenol和乙酰胆碱激动剂Carbachol也显现出与大鼠胚胎心肌细胞(rFCMs)类似的反应。　　结论：研究结果建立了新的rESCs体外分化体系，并在国际上率先证实rESCs可以在体外分化为具有功能性的心肌细胞。该分化模型为研究心脏发生、发育的分子机制、心肌细胞药物毒性检测和促进心肌细胞分化、改善心肌细胞收缩和心电功能的化合物筛选提供了新的工具，也为进一步开展细胞治疗研究提供了新途径。