论文部分内容阅读
目的通过高通量测序技术筛选子痫前期孕妇外周血及胎盘组织中的microRNA,运用生物信息学的分析方法,精确比较样本间microRNA差异表达谱,选择显著差异的miRNA进行靶基因预测,分析功能类别以及基因与相应基因本体(GO)之间的关联。着重分析靶基因的功能分布,确定差异miRNA在子痫前期疾病中的生物学功能。方法1)收集2017年1月至2017年12月在四川省人民医院分娩的年龄、产次相匹配的正常妊娠及子痫前期孕妇外周血、胎盘各3例,共12例,形成正常与疾病对照组。2)从收集的全血中分离血清,提取总RNA后分别连接5’接头和3’接头,进行PCR扩增,凝胶电泳法获取片段在18-40nt左右的cDNA文库;使用Illumina HiSeqTM 2500进行高通量测序,初步过滤数据,得到干净序列(clean reads),对其分布及共有序列进行统计、分类注释,获得样本所含各类sRNA的组分和表达量信息。3)将所得的测序数据与miRNA生物信息数据库(miRBase数据库(version 21))比对,获取miRNA的表达信息:长度、结构、表达水平等,计算其表达量。4)判断样本间miRNA的差异表达量,采用edgeR分析各组间miRNA差异的显著性,计算P值。取P<0.01为高显著差异,P<0.05为一般显著差异。5)通过生物信息学分析方法筛选差异表达的miRNAs,运用TargetScan、PicTar、miRDB及Tarbase等多种软件预测和筛选候选miRNAs靶基因。并将差异靶基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。并使用GESA软件(v3.0)进行验证基因富集分析。使用Ggplot2软件对GSEA分析的结果进行说明。使用David数据库分析功能类别以及基因与相应基因本体(GO)之间的关联。结果1、子痫前期血清差异microRNA:两组样品间共有725个差异表达的miRNA,有343个miRNA表达上调,有382个mi RNA表达下调。0.01<P<0.05之间的有41个,P<0.01的有3个(miR-455-3p,miR-103a-2-5p,miR-449c-5p)。2、子痫前期胎盘组织中microRNA:两组样品中共有180个差异表达的miRNA,有90个miRNA表达上调、90个表达下调。0.01<P<0.05之间有27个,P<0.01有24个。3、靶基因预测及生物信息学分析挑选miR-455-3p、miR-103a-2-5p、miR-449c-5p、miR-187-3p、miR-217、miR-365b-5p利用TargetScan、PicTar、miRDB及Tarbase等多种软件预测和筛选候选的miRNAs靶基因,得到候选靶基因分别是11、409、158、7、7、20个。其中四个软件共同的预测靶基因有4、2、3、3、3、3个。在挑选miR-455-3p、miR-103a-2-5p、miR-449c-5p、miR-187-3p、miR-217、miR-365b-5p,对其候选靶基因进行KEGG和GO分析,KEGG分析显示上调基因所涉及的靶基因通路可能包括:P53信号通路、胃酸分泌通路、TGF-β信号通路、细胞因子及其受体的相互作用等。下调基因所涉及的靶基因通路包括:慢性髓细胞样白血病、癌症中的蛋白、神经营养因子的信号转导、胰岛素信号通路、MAPK信号通路(AMP依赖的蛋白激酶)等。在收集的胎盘血清样本和GEO数据库中,子痫前期中的jak-stat信号通路均被激活。结论1、子痫前期患者血清及胎盘组织中的miRNA表达与正常孕妇血清及胎盘相比较中有较大差异,表明子痫前期患者血液循环、胎盘或二者同时在疾病过程中都存在表达异常。2、在PE发病过程中,血清中miR-455-3p、miR-103a-2-5p、miR-449c-5p的上调,胎盘组织中miR-187-3p、mi R-217、miR-365b-5p可能成为研究的关键miRNA。3、SERPINA3作为弹性蛋白酶的蛋白酶抑制剂参与胎盘疾病,在子痫前期的发病中至关重要。jak-stat信号通路的激活可能促进PE的发病。