新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的鸡、火鸡和多种禽类的急性、高度接触性传染病,严重危害禽类。H9N2虽是低致病性禽流感,但可以对禽类造成严重的免疫抑制,增加继发感染其他病原体的可能性。ND与H9N2在临床上发病较多,危害较大,二者的混合感染会加重患病禽群的病情,给养禽业带来很大的损失。关于NDV与H9N2亚型AIV共感染的研究较为有限,近年来的研究只是初步探索了二者之间的相互影响情况,而两种病毒共感染的过程和致病机制尚不清楚。本研究旨在建立一个NDV与H9N2亚型AIV共感染的体外细胞模型,比较和分析两种病毒共感染鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF)后,单一感染组与共感染组病毒在RNA水平、病毒滴度及相关免疫因子等方面的变化,为研究共感染条件下宿主对病毒的免疫应答和抵抗机制打下基础,为临床防制ND和H9N2混合感染提供新思路和新方向。具体分为4个部分:1.本研究参照GenBank上发表及相关文献中的NDV与H9N2亚型AIV的M基因序列设计合成4对引物,以抽提的病毒尿囊液中的cDNA为模板,分别扩增出M基因,将其连接到pMD19-T载体上,筛选出M基因标准阳性质粒,并用q-PCR方法建立标准曲线。2.设计NDV与H9N2亚型AIV在CEF细胞上的共感染实验,制作标准曲线分别检测实验组NDV与H9N2亚型AIV的拷贝数。结果表明,在6 h、12 h时,单一感染组的细胞培养物中M基因的拷贝数要比共感染组高,病毒复制速度较慢;在24 h、36 h、48 h时,单一感染组的细胞培养物中M基因的拷贝数要比共感染组低,且病毒复制速度较快。由此初步断定:在整个病毒复制内,24 h之前,共感染组中NDV与H9N2亚型AIV互相抑制,24 h之后,二者相互促进对方在CEF细胞内的复制。3.利用细胞免疫组化技术(immunohistochemical,ICC)分别测定实验组中NDV与H9N2亚型AIV的增殖曲线。结果显示,在整个复制周期内,单一感染NDV组的病毒滴度要高于混合感染组,而单一感染H9N2亚型AIV组的病毒滴度要低于混合感染组,说明在发生共感染时,H9N2亚型AIV会抑制NDV在CEF细胞内的复制,而NDV会促进H9N2亚型AIV在CEF细胞内的复制。4.利用q-PCR测定了6个固有免疫相关因子IFN-α、IFN-β、IL18、IL-1β、TLR4、及NLRC5的表达,对比分析其表达情况。IFN-α、IFN-β基因有早期阶段的表达抑制,共感染后期,二者均呈现上调;IL-1β基因在整个共感染阶段都呈现上调;IL18、TLR4与NLRC5基因在早期阶段没有明显的表达变化,共感染后期均呈现上调。结果表明,在NDV与H9N2亚型AIV共感染CEF细胞24 h后,二者互相促进对方的复制并共同作用于CEF细胞,加重了对CEF细胞的感染力。