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目的类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以滑膜组织增生及慢性关节滑膜炎症浸润为主要病理特征的系统性自身免疫病,关节滑膜成纤维细胞的异常增殖及凋亡减少是滑膜组织增生的重要发病机制之一。已有研究报道钙网织蛋白(Calreticulin,CRT)可能与RA的发病有关。本课题组前期研究亦发现,CRT在RA患者血清、滑膜及关节液中均呈现高表达,血清CRT表达量与RA患者的疾病活动度评分DAS28正相关,且CRT可通过NO途径参与RA滑膜血管翳的形成。有研究报道CRT可抑制胞外死亡受体途径之一的Fas-Fas L介导的T细胞凋亡进而参与RA的发病机制。本课题拟探讨CRT通过调节抗凋亡蛋白c-FLIP表达进而抑制胞外死亡受体途径介导的RA滑膜成纤维细胞凋亡,进而参与RA滑膜增生及炎症浸润的发病机制,为临床RA滑膜炎症的靶向治疗提供新的理论依据和实验基础。方法1.于2014年1月至2015年5月收集行关节镜及膝关节置换术患者的标本进行实验研究。关节滑液标本包括:RA患者32例,OA患者37例。滑膜组织标本包括:RA患者14例,OA患者19例。2.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测RA及OA患者关节滑液中CRT的含量。3.采用免疫组织化学方法分析CRT和c-FLIP蛋白在RA及OA滑膜组织中的表达和定位并对结果进行半定量分析;同时对CRT及c-FLIP的表达量进行相关性分析。4.采用联合酶消化法分离RA及OA滑膜成纤维细胞并进行培养,观察分析RA及OA滑膜成纤维细胞在体外生长的特性。5.采用CCK-8试验分析CRT对RA滑膜成纤维细胞增殖能力的影响。6.采用流式细胞技术分析CRT对TRAIL诱导的RA滑膜成纤维细胞凋亡的影响。7.采用细胞免疫荧光方法检测RA滑膜成纤维细胞中CRT及c-FLIP蛋白的表达及细胞定位。8.采用免疫印迹法(Western Blot)及实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测RA滑膜成纤维细胞中c-FLIP蛋白及m RNA的表达,分析外源性CRT对滑膜成纤维细胞表达c-FLIP的影响并评估CRT介导的c-FLIP表达在NF-κB信号通路活化中的作用。9.采用SPSS 20.0软件包进行统计学分析。计量资料以(?)±s表示。分别采用t检验、SNK-q检验、Pearson线性相关性分析等进行相关的统计学处理。检验水准为双侧α=0.05。结果1.ELISA结果显示,RA患者关节滑液中CRT含量[(7.2±3.0)ng/ml]显著高于OA患者[(3.8±0.6)ng/ml](t=6.724,P<0.01)。2.免疫组织化学结果显示,RA关节滑膜组织CRT和c-FLIP均呈高表达,滑膜组织的衬里层和衬里下层、炎性细胞及血管周围有较多阳性染色。相较而言,OA滑膜中CRT和c-FLIP仅在衬里层及血管周围有极少量的表达。RA滑膜组织中CRT的表达量与c-FLIP呈正相关。3.两组刚贴壁的细胞呈圆形,后逐渐延伸为长梭形或纺锤形。RA患者滑膜成纤维细胞原代细胞在接种后12~24h即开始贴壁,4~5天后铺满瓶底,OA患者滑膜成纤维细胞原代细胞贴壁生长缓慢,接种后24~48h开始贴壁,直至7~8天后达到融合状态。传代后细胞生长变快,RA组细胞每2~3天即可传代1次,而OA组细胞传代需培养3~4天。4.CCK-8结果显示,CRT具有促进RA滑膜成纤维细胞增殖的作用。5.CRT对凋亡诱导剂TRAIL诱导的RA滑膜成纤维细胞凋亡具有抑制作用。6.qRT-PCR、Western Blot以及细胞免疫荧光检测结果均表明,与OA患者的滑膜成纤维细胞相比,RA患者滑膜成纤维细胞中CRT和c-FLIP的m RNA及蛋白表达水平均明显升高。7.q RT-PCR和Western Blot的检测结果显示,不同剂量的人重组CRT作用后,RA滑膜成纤维细胞中c-FLIP的m RNA表达水平和蛋白表达水平均升高,且c-FLIP表达水平的升高呈CRT浓度依赖性。8.在CRT的作用下,RA滑膜成纤维细胞中p-NF-κB表达水平明显升高,而总NF-κB蛋白表达水平没有明显的改变。应用NF-κB信号通路抑制剂后,CRT上调RA滑膜成纤维细胞中c-FLIP表达的作用被抑制。结论1.CRT与c-FLIP在RA患者滑膜组织中的表达量均升高,且CRT与c-FLIP在RA患者滑膜组织中表达量呈正相关2.体外实验中发现,RA滑膜成纤维细胞中,CRT与c-FLIP均呈高表达,CRT可上调RA滑膜成纤维细胞c-FLIP的表达,且具有剂量依赖性。3.CRT可能通过调节RA滑膜成纤维细胞中抗凋亡蛋白c-FLIP的表达激活NF-κB通路进而参与RA滑膜组织增生及炎症持续过程。本课题研究结果提示RA患者滑膜成纤维细胞CRT及抗凋亡蛋白c-FLIP表达增加,且CRT可能通过调控c-FLIP的表达使得滑膜成纤维细胞凋亡减少,且可能通过对c-FLIP的调节激活NF-κB信号通路,进而促进RA滑膜组织增生及炎症反应,参与RA病理机制。