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目的:本文通过动物实验,从多角度、多靶点探讨不同时间点益气养阴活血通络法干预特发性肺纤维化氧化应激机制研究,并探讨其对NO、H2O2、SOD、CAT、GSH-px、Keap1/Nrf2信号转导通路及其下游HO-1、NQO-1、γ-GCS蛋白/mRNA表达的影响,从而探究益气养阴活血通络法干预特发性肺纤维化氧化应激机制,为临床诊治特发性肺纤维化提供新的科学依据和诊疗经验。材料与方法:将144只SPF级Wistar雄性大鼠随机分为六组,分别为空白对照组、模型对照组、醋酸泼尼松对照组（简称西药组）、益气养阴活血通络高剂量组（简称中药高剂量组）、益气养阴活血通络中剂量组（简称中药中剂量组）、益气养阴活血通络低剂量组（简称中药低剂量组）,通过各组大鼠一般情况、肺病理形态学变化情况、HE染色结果、肺泡炎病理学积分结果、肺纤维化病理学积分对肺纤维化模型大鼠进行评价,并于第7天、第14天、第28天三个时间点进行实验取材和指标测定。通过比色法及紫外可见分光光度法检测氧化自由基（NO、H2O2）及抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-px）的表达,阐明益气养阴活血通络法对肺纤维化大鼠抗氧化能力的影响;通过Western-blot法及RT-PCR的方法,多层次、多角度揭示不同时间点肺组织Keap1（胞浆蛋白）、Nrf2（胞核蛋白）、p-Nrf2（胞核蛋白）蛋白和mRNA的动态表达,阐明益气养阴活血通络法调控肺纤维化模型大鼠keap1/Nrf2信号转导通路的作用机制;通过Western-blot法及RT-PCR的方法,多层次、多角度揭示不同时间点肺组织HO-1、NQO-1、γ-GCS蛋白和mRNA的动态表达,进一步研究益气养阴活血通络法调控IPF模型大鼠氧化应激的机制。结果:1.益气养阴活血通络法可以改善大鼠的一般状态,能有效抑制早期肺泡炎,改善中晚期肺内纤维化沉积,改善大鼠肺组织病理形态。2.益气养阴活血通络法能够上调SOD,CAT,GSH-px的含量,下调NO、H2O2发挥抗氧化的作用,延缓肺纤维化的进程,且中药高剂量的疗效最佳。与空白对照组比较,其余各组NO、H2O2含量显著上调,此时肺纤维化大鼠产生氧化应激反应,自由基大量生成;与模型对照组比较,西药组、中药高、中、低剂量组NO含量显著下调,推测西药和中药发挥抗氧化作用;中药高剂量组与西药组相比,NO、H2O2含量下降无统计学差异,可见中药高剂量疗效最佳;与空白对照组比较,其余各组肺组织中SOD,CAT,GSH-px含量显著下降,可见,在肺纤维化大鼠模型肺组织中产生氧化应激反应导致SOD,CAT,GSH-px活性及含量下降有关;与模型对照组比较,西药组、中药高、中、低剂量组SOD,CAT,GSH-px含量显著上调,可见西药和中药可能通过提高SOD,CAT,GSH-px含量发挥抗氧化作用;中药高剂量组与西药组相比,NO、H2O2含量下降无统计学差异,可见,中药高剂量与西药具有相近的抗氧化效能;中药抗氧化效能随着药物浓度增加而提高。3.益气养阴活血通络法能够抗氧化应激,主要是调控Keap1/Nrf2信号转导通路发挥抗氧化的作用,延缓肺纤维化的进程。空白对照组的Keap1蛋白和mRNA在第7天、第14天、第28天三个时间点内呈现高表达状态,即正常肺组织内Keap1蛋白和mRNA表达水平较高;空白对照组的Nrf2蛋白和mRNA在第7天、第14天、第28天三个时间点内仅有少量表达,即正常肺组织内Nrf2蛋白和mRNA表达水平较低;空白对照组的p-Nrf2蛋白在第7天、第14天、第28天三个时间点内仅有少量表达。经博莱霉素造模后的模型对照组大鼠Keap1蛋白和mRNA与同期空白对照组相比均有不同程度的明显下调,且随时间的推进逐渐下降,表明IPF氧化应激过程中肺组织内Keap1蛋白和mRNA表达呈现下调状态;模型对照组大鼠Nrf2蛋白和mRNA与同期空白对照组相比均有不同程度的明显上调,表明IPF氧化应激过程中肺组织内Nrf2蛋白和mRNA表达呈现上调状态;模型对照组大鼠p-Nrf2蛋白与同期空白对照组相比均有不同程度的明显上调,表明IPF氧化应激过程中肺组织内Nrf2蛋白和mRNA表达呈现上调状态。经过药物治疗后,随着肺纤维化程度的减缓,与模型对照组比较,西药组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组Keap1蛋白和mRNA均有不同程度的下调;与模型对照组比较,西药组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组Nrf2蛋白和mRNA均有不同程度的上调;与模型对照组比较,西药组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组p-Nrf2蛋白均有不同程度的上调,即提示益气养阴活血通络法能够抑制Keap1蛋白和mRNA的表达,促进Nrf2蛋白和mRNA的表达,提高p-Nrf2蛋白的表达以增强体内抗氧化活性,抑制机体过度氧化,并且与西药组比较,中药高剂量组大鼠肺组织中Keap1蛋白和mRNA、Nrf2蛋白和mRNA、p-Nrf2蛋白表达水平基本无统计学差异,提示中药高剂量药的干预作用与西药泼尼松的作用相当。故推测益气养阴活血通络法通过干预Keap1/Nrf2信号转导通路,进而抑制肺组织的损伤与过度修复。4.益气养阴活血通络法通过上调肺纤维化模型大鼠HO-1、NQO-1、γ-GCS蛋白/mRNA的表达,发挥抗氧化的作用。实验结果表明,空白对照组的HO-1蛋白和mRNA在第7、14、28天三个时间点内只有少量表达。经博莱霉素造模后的各组大鼠HO-1与同期空白对照组相比均有不同程度的明显上调,表明肺组织内HO-1表达增高与肺纤维的形成密切相关,推测其在介导肺泡炎症和肺损伤中发挥重要作用。经过药物治疗后,与模型对照组比较,给各组药大鼠肺组织中HO-1蛋白和mRNA表达均有不同程度的上调。与西药组比较,中药高剂量组蛋白表达水平显著上调,中药低剂量组蛋白表达水平显著下调,中药中剂量组蛋白表达水平无统计学差异,提示中药高剂量组疗效最好。与空白对照组相比,模型对照组大鼠肺组织中NQO-1的蛋白和mRNA表达在第7、14、28三个时间点内均有明显下调。经博莱霉素造模后的各组大鼠NQO-1与同期空白对照组相比均有不同程度的明显下调,推测其在肺泡炎症和肺损伤中发挥重要作用。经过药物治疗后,与模型对照组比较,给各组药大鼠肺组织中NQO-1的蛋白和mRNA表达均有不同程度的上调,表明药物作用激发体内的抗氧化作用。与西药组比较,中药中剂量组蛋白表达水平显著下调,中药低剂量组蛋白表达水平显著下调,中药高剂量组蛋白表达水平无统计学差异。与中药高剂量量组比较,中药中剂量组、中药低剂量组蛋白显著下调,可以看出中药高剂量组疗效最佳。空白对照组的γ-GCS蛋白和mRNA在第7、14、28天三个时间点内只有少量表达,即正常肺组织内γ-GCS蛋白和mRNA表达水平较低。经博莱霉素造模后的各组大鼠γ-GCS与同期空白对照组相比均有不同程度的明显上调,表明肺组织内γ-GCS表达增高与肺纤维的形成密切相关,推测其在介导肺泡炎症和肺损伤中发挥重要作用。经过药物治疗后,与模型对照组比较,给各组药大鼠肺组织中γ-GCS蛋白和mRNA表达均有不同程度的上调。与西药组比较,中药高剂量组蛋白表达水平显著上调,中药低剂量组蛋白表达水平显著下调,中药中剂量组蛋白表达水平无统计学差异,提示中药高剂量组疗效最好。提示益气养阴活血通络法对通过升高HO-1、NQO-1、γ-GCS水平,发挥抗氧化的作用,达到治疗肺纤维化的目的。结论:1.基于络病学说与“肺络构效”理论,提出IPF的核心病机为“肺虚络瘀”:“肺虚”即肺肾气阴两虚,“络瘀”即血瘀脉络,进而提出“益气养阴、活血通络”为肺纤维化治疗大法,拟中药复方参龙煎剂论治。2.益气养阴活血通络法可能通过下调肺组织NO、H2O2等氧自由基的含量和上调SOD、CAT、GSH-px等抗氧化酶的含量,抑制肺纤维化氧化应激,从而延缓IPF进展。3.益气养阴活血通络法可能通过下调Keap1蛋白和mRNA含量,上调Nrf2蛋白和mRA含量以及上调p-Nrf2蛋白含量以调控Keap1/Nrf2信号转导通路,抑制肺纤维化氧化应激,从而延缓IPF进展。4.益气养阴活血通络法可能通过上调HO-1蛋白和mRNA的表达,上调γ-GCS蛋白和mRNA的表达,上调NQO-1蛋白和mRNA的表达以促进Keap1/Nrf2信号转导通路调控的下游靶蛋白和基因,抑制肺纤维化氧化应激,从而延缓IPF进展。5.益气养阴活血通络法调控氧化应激相关氧自由基、抗氧化酶的作用,可能是通过调节Keap1/Nrf2信号转导通路以及促进Keap1/Nrf2信号转导通路调控的下游靶蛋白和基因而实现的,进而延缓IPF进展。