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脓毒症(Sepsis)是一种多器官功能障碍相关的疾病,通常是由宿主感染外病原体,免疫反应与炎症反应失衡,造成全身炎症反应综合征。脓毒血症炎症导致的心功能障碍性疾病是危害人类健康最主要原因之一,同时也带来沉重的经济负担。脓毒症性心肌病伴随着心肌细胞活性氧、炎症因子、凋亡的增加,进一步加重心肌重构。硒(Selenium,Se),一种人体必要微量元素,很多研究发现它具有抗氧化应激、抗炎症、抗凋亡的功能,然而硒是否可以改善脓毒症诱导的心肌细胞损伤,这一机制尚不明确。因此,本课题用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠心肌细胞损伤来构建脓毒症对心肌的影响,探究硒(Selenium,Se)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的心肌损伤的作用机制。首先,第一部分我们采取体内培养,给小鼠注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)构建脓毒症引起的心肌功能障碍模型,同时给小鼠喂食硒,观察硒对脂多糖小鼠心肌功能的影响。第二部分,我们采用体外培养H9C2心肌细胞,构建脂多糖诱导H9C2心肌细胞心肌损伤模型,观察硒是否在体外模型中改善脂多糖诱导的H9C2心肌细胞心肌损伤。第三部分,我们用脂多糖注射小鼠,检测其干扰素基因刺激因子(Stimulator of interferon genes,Sting)、磷酸化干扰素调节因子3(Phospho Interferon regulatory factor 3,P-IRF3)的表达,用Sting抑制剂C178干预脂多糖诱导H9C2心肌细胞心肌损伤模型,观察脂多糖诱导心肌损伤是否是通过Sting信号通路来介导细胞炎症的。本论文包括3部分第一部分:硒改善脂多糖诱导小鼠的心肌损伤目的:观察硒是否改善脂多糖诱导小鼠的心肌损伤。方法:1.小鼠模型建立及实验分组:将雄性8周龄C57BL/6 J小鼠给与注射10mg/kg生理盐水或10mg/kg脂多糖30天,部分小鼠提前喂食0.2mg/kg硒2周,实验分组如下:(1)对照组(control),(2)脂多糖组(LPS),(3)硒+脂多糖组(Se+LPS)。2.心功能检测:超声检测各组实验小鼠左室舒张末期内径(LVEDD,Left ventricular end diastolic dimension)、左室收缩末期内径(LVESD,Left ventricular end systolic dimension)、左室射血分数(LVEF,Left ventricular ejection fraction)、左心室收缩功能(LVSF,Left ventricular systolic function)指标。3.组织的留取:将实验小鼠喂养30天称重、进行超声后,腹腔麻醉处死小鼠,取肝、肺,用4℃生理盐水清洗,并称量其干、湿重。4.血清学检测LDH、CK-MB:实验小鼠喂养30后,在处死之前腹腔麻醉,眼球取血,4℃12000g 5min进行离心,根据乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒和肌酸激酶同工酶(CK-MB)试剂盒说明书加试剂检测血清中的LDH、CK-MB。5.心脏组织炎症指标检测:用TRIzol试剂从小鼠心脏组织中纯化总RNA,用逆转录系统合成c DNA。使用SYBR绿色PCR主试剂盒和ABI PRISM 7500检测系统进行实时定量PCR测定IL-1β、IL-6和TNF-a,匀浆小鼠组织,收集上清,IL-1β、IL-6和TNF-a的水平由试剂盒测定。6.心脏组织氧化应激检测:将小鼠心脏组织称重并在PBS中的冰上匀浆。在4℃下以10000g离心20分钟后,获得上清液并进行分析。用超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒和丙二醛(MDA)试剂盒测定其含量。7.心脏组织凋亡测定:匀浆小鼠组织,收集上清,用caspase-3试剂盒,caspase-8试剂盒和caspase-9试剂盒检测凋亡指标caspase-3、caspase-8和caspase-9的表达,实时定量PCR测定caspase-3、caspase-8和caspase-9,蛋白印迹检测Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白的表达。结果1.各组实验小鼠器官重量:与对照组(control)相比,脂多糖组(LPS)小鼠体重(BW)、左室重量(LVW)明显增加(P<0.05,vs对照组),在脂多糖组(LPS)小鼠喂食硒后,心脏重量/体重(Total HW/BW)和左室重量/体重(LVW/BW)明显降低(心脏重量/体重,P<0.05;左室重量/体重,P<0.05;vs脂多糖组),其余组间并无统计学差异。各组心脏重(HW)、肺重(Lung W)、肺重/体重(Lung W/BW)虽然也并未有统计学差异。2.心功能检测:与对照组(Control)相比,脂多糖组(LPS)左室舒张末期内径(LVEDD)和左室收缩末期内径(LVESD)显著增加(左室舒张末期内径,P<0.05;左室收缩末期内径,P<0.01;vs对照组),硒的治疗改善了脂多糖引起的左室舒张末期内径(LVEDD)和左室收缩末期内径(LVESD)的增加(左室舒张末期内径,P<0.05;左室收缩末期内径,P<0.05;vs脂多糖组)。脂多糖组(LPS)与对照组(Control)相比,左室射血分数(LVEF)和左心室收缩功能(LVSF)显著降低(左室射血分数,P<0.01;左心室收缩功能,P<0.05;vs对照组),在硒+脂多糖组(Se+LPS)组,左室射血分数(LVEF)和左心室收缩功能(LVSF)显著升高(左室射血分数,P<0.05;左心室收缩功能,P<0.05;vs脂多糖组)。3.血清学检测LDH、CK-MB:脂多糖喂食增加了小鼠血清中心肌损伤标志物乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸肌酶同工酶(CK-MB)的表达(乳酸脱氢酶,P<0.01;肌酸肌酶同工酶,P<0.01;vs对照组),硒抑制了脂多糖诱导的小鼠血清中心肌损伤标志物的升高(乳酸脱氢酶,P<0.05;肌酸肌酶同工酶,P<0.05,vs脂多糖组)。4.心脏组织炎症指标检测:脂多糖组(LPS)中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达与与对照组(Control)相比,明显升高(IL-1β,P<0.05;IL-6,P<0.01;TNF-α,P<0.01;vs对照组),硒抑制了脂多糖诱导的炎症因子的升高(IL-1β,P<0.05;IL-6,P<0.01;TNF-α,P<0.01;vs脂多糖组)。同样,QRT-PCR检测m RNA IL-1β、m RNA IL-6和m RNA TNF-α呈现出相同的趋势。蛋白印迹检测中,脂多糖组(LPS)IL-1β、IL-6和TNF-α表达升高(IL-1β,P<0.01;IL-6,P<0.01;TNF-α,P<0.05;vs对照组),硒+脂多糖组(Se+LPS)IL-1β、IL-6和TNF-α表达下降(IL-1β,P<0.05;IL-6,P<0.01;TNF-α,P<0.05;vs脂多糖组)。5.心脏组织氧化应激检测:超氧化酶歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量在脂多糖组(LPS)明显降低,丙二醛(MDA)含量升高(超氧化酶歧化酶,P<0.05;谷胱甘肽过氧化物酶,P<0.05;丙二醛,P<0.01;vs对照组),在加入硒后,超氧化酶歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)含量明显升高,丙二醛(MDA)含量降低(超氧化酶歧化酶,P<0.05;谷胱甘肽过氧化物酶,P<0.05;丙二醛,P<0.01;vs脂多糖组)。6.心脏组织凋亡测定:与对照组(Control)相比,脂多糖组(LPS)中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达显著升高(Caspase-3,P<0.01;Caspase-8,P<0.01;Caspase-9,P<0.01;vs对照组),硒抑制了脂多糖组(LPS)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达的升高(Caspase-3,P<0.01;Caspase-8,P<0.01;Caspase-9,P<0.05;vs脂多糖组)。凋亡相关基因m RNA Caspase-3、m RNA Caspase-8、m RNA Caspase-9呈现出相同的趋势。蛋白印迹检测中,与对照组(Control)相比,脂多糖组(LPS)中Cleaved caspase-3、Bax表达显著升高(Cleaved caspase3,P<0.05;Bax,P<0.01;vs对照组),硒抑制了脂多糖组(LPS)Caspase-3、Bax蛋白表达的升高(Cleaved caspase3,P<0.01;Bax,P<0.05;vs脂多糖组)。Bcl-2蛋白在脂多糖组(LPS)降低,虽然趋势不明显,但硒改善了脂多糖诱导的Bcl-2蛋白的下降(Bcl-2,P<0.05;vs脂多糖组)。结论:脂多糖诱导小鼠心肌损伤后的心肌重构,硒可以改善脂多糖诱导小鼠的心肌损伤,硒可能有利于脂多糖小鼠心肌损伤的治疗。第二部分:硒改善脂多糖诱导的H9C2心肌细胞损伤目的:观察硒是否改善脂多糖诱导H9C2心肌细胞的损伤。方法:1.MTT检测:MTT法检测不同浓度硒脂多糖诱导H9C2心肌细胞损伤的影响。分组如下:对照组(control)、100n M硒(100n M Se)、250n M硒(250n M Se)、500nM硒(500nM Se)、1000nM硒(1000nM Se)、2000nM硒(2000nM Se)。2.细胞中LDH测定:用裂解液裂解细胞,用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞内的LDH。分组如下:对照组(control)、脂多糖组(LPS)、硒+脂多糖组(Se+LPS)。3.细胞氧化应激检测:将H9C2细胞PBS中的冰上匀浆。在4℃下以10000g离心20分钟后,获得上清液并进行分析。用超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒和丙二醛(MDA)试剂盒含量的测定。分组(1)对照组(control)、脂多糖组(LPS)、硒+脂多糖组(Se+LPS);(2)对照组(control):、过氧化氢组(H2O2)、过氧化氢组(H2O2+Se)。4.细胞内炎症因子测定:H9C2心肌细胞裂解,IL-1β试剂盒、IL-6试剂盒和TNF-a试剂盒测定IL-1β、IL-6和TNF-a的含量。5.细胞凋亡蛋白检测:细胞分组(1)对照组(control)、脂多糖组(LPS)、硒+脂多糖组(Se+LPS),蛋白印迹检测凋亡蛋白Cleaved caspase3、Bax和Bcl-2蛋白的表达;(2)对照组(control)、脂多糖组(LPS)、BAY11-7082+脂多糖组(BAY11-7082+LPS),Caspase 3试剂盒检测细胞内Caspase 3的表达。结果:1.MTT法检测硒在0n M(control)、100n M、250n M、500n M、1000n M、2000n M对H9C2细胞的影响,结果现在硒在各浓度梯度对H9C2细胞的生存率无影响。因此我们选用100n M硒作为细胞造模的干预浓度。2.细胞中LDH测定:与对照组(Control)相比,脂多糖诱导H9C2细胞乳酸脱氢酶(LDH)表达增高(乳酸脱氢酶,P<0.01;vs对照组),硒缓解脂多糖诱导H9C2细胞乳酸脱氢酶(LDH)表达增高(乳酸脱氢酶,P<0.01;vs脂多糖组)。3.细胞氧化应激检测:与对照组(Control)相比,脂多糖干预使丙二醛(MDA)含量明显升高,而超氧化酶歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)水平显著明显降低,(超氧化酶歧化酶,P<0.01;谷胱甘肽过氧化物酶,P<0.001;丙二醛,P<0.001;vs对照组)。然而,硒治疗显著逆转了这些变化并抑制了脂多糖诱导的心脏氧化损伤,虽然硒对超氧化酶歧化酶改善不太明显,(超氧化酶歧化酶,P>0.05;谷胱甘肽过氧化物酶,P<0.01;丙二醛,P<0.001;vs脂多糖组)。为了证明硒可以抑制氧化应激,我们用外源性活性氧H2O2来干预H9C2细胞,结果表明硒通过抑制氧化应激来改善氧化损伤。4.细胞内炎症因子测定:脂多糖组诱导H9C2细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达升高(IL-1β,P<0.001;IL-6,P<0.001;TNF-α,P<0.01;vs对照组),硒的治疗缓解脂多糖组诱导H9C2细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达升高(IL-1β,P<0.01;IL-6,P<0.001;TNF-α,P<0.05;vs脂多糖组)。5.细胞凋亡蛋白检测:蛋白印迹检测了凋亡蛋白Cleaved caspase3、Bax,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。与对照组(Control)相比,脂多糖组(LPS)中Cleaved caspase-3增高,虽然无显著差异,Bax表达显著升高(Bax,P<0.01;vs对照组),硒抑制了脂多糖组(LPS)Cleaved caspase-3、Bax蛋白表达的升高(Cleaved caspase-3,P<0.001;vs脂多糖组)。Bcl-2蛋白在脂多糖组(LPS)降低,虽然趋势不明显,但硒改善了脂多糖诱导的Bcl-2蛋白的下降(Bcl-2,P<0.01;vs脂多糖组)。为了测定炎症是否引起凋亡,我们采用炎症抑制剂BAY11-7082干预H9C2细胞,结果发现炎症抑制剂BAY11-7082逆转脂多糖诱导凋亡蛋白Caspase 3的增加(Caspase-3,P<0.001;vs脂多糖组)。结论:脂多糖诱导H9C2细胞的产生氧化应激、炎症反应和细胞凋亡,硒抑制这一现象的产生,抑制氧化应激、炎症反应和细胞凋亡的产生将为脂多糖诱导H9C2细胞损伤的治疗提供新的思路。第三部分:硒通过Sting通路改善脂多糖诱导的心肌损伤目的:Sting激活炎症反应的发生。观察硒是否通过Sting通路改善脂多糖诱导心肌细胞损伤。方法:1.Sting、P-IRF3蛋白在心脏组织的表达:分组对照组(control)、脂多糖组(LPS)、硒+脂多糖组(Se+LPS)QRT-PCR检测各实验组心脏组织中Sting的表达,蛋白印迹检测各实验组心脏组织中Sting、P-IRF3蛋白的表达。2.Sting通路对H9C2心肌细胞炎症的影响:分组对照组(control)、脂多糖组(LPS)、C178+脂多糖组(C178+LPS),蛋白印迹检测各实验组H9C2心肌细胞炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白的表达。结果:1.Sting、P-IRF3蛋白在心脏组织的表达:QRT-PCR检测结果显示,与对照组(Control)相比,脂多糖(LPS)组中脂多糖显著提高心脏组织中Sting的m RNA水平(Sting m RNA,P<0.01,vs对照组),硒抑制了脂多糖诱导的心脏组织中Sting的m RNA水平的升高(Sting m RNA,P<0.01,vs脂多糖组)。蛋白印迹检测各实验组Sting蛋白的表达呈现出相同的趋势(Sting,P<0.05,vs对照组;Sting,P<0.05,vs脂多糖组)。P-IRF3蛋白在脂多糖(LPS)组中表达显著增高,硒改善了这一现象(P-IRF3,P<0.05,vs对照组;P-IRF3,P<0.05,vs脂多糖组)。2.Sting通路对H9C2心肌细胞炎症的影响:与对照组(Control)相比,脂多糖显著增加H9C2心肌细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白的表达(IL-1β,P<0.01;IL-6,P<0.01;TNF-α,P<0.01;vs对照组),Sting抑制剂C178改善了脂多糖诱导的H9C2心肌细胞IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表达的升高(IL-1β,P<0.01;IL-6,P<0.05;TNF-α,P<0.05;vs脂多糖组)。结论:脂多糖通过激活Sting通路及下游P-IRF3来引起炎症反应,硒通过抑制该通路改善脂多糖诱导的心肌炎症。