近年来随着我国人民生活水平的提高,对羊肉需求量不断增加。对地方肉羊品种开展保护与利用,将有效提升我国养羊业的发展水平。乌珠穆沁羊属蒙古羊血统,是我国重要的肉羊品种,其种群中的多脊椎突变个体可显著提高羊肉产量,对牧区发展肉羊产业、增加牧民经济收入具有重要意义。发育遗传学研究发现多脊椎性状受到Homeobox gene(同源框基因,简称为Hox)基因的调控,是少数基因突变的结果,能够稳定遗传;预测Hoxc8基因主要调控胸椎的形成,其突变会导致胸椎发育数量的改变,然而这些发现及预测并没有得到充分的分子生物学验证。本研究克隆了绵羊Hoxc8基因的CDS区域,分别构建了该基因的过表达载体和敲除载体。不同载体转染脂肪间充质干细胞后通过筛选单克隆得到了干扰Hoxc8基因表达量的转基因干细胞模型。通过比较不同干细胞转录本内随Hoxc8基因表达量的改变而密切相关的基因及信号通路变化,探究Hoxc8基因对干细胞代谢调控的影响,并进一步研究Hoxc8基因由干细胞向成骨细胞分化过程中的变化趋势;最后,结合干细胞转录本和骨方向分化的数据,在基因组层面上找寻Hoxc8基因与多脊椎性状成因的关系。研究结果为今后进一步探究乌珠穆沁羊多脊椎性状的分子机制奠定基础。一、Hoxc8基因过表达和敲除干细胞的获得本实验首先克隆了绵羊Hoxc8基因的CDS区域,与NCBI参考序列比对率为100%。将CDS序列连入哺乳动物真核表达载体的多克隆位点处,构建了Hoxc8基因过表达载体;同时根据Hoxc8基因CDS上外显子的数量利用CRISPR-Cas9技术构建了Hoxc8基因的敲除载体。构建的两个载体为下步获得转基因细胞提供了质粒材料。Hoxc8基因过表达载体转染脂肪间充质干细胞后通过G148筛选法和有限稀释法筛选阳性细胞:对比细胞增殖活性和细胞凋亡后发现,两种方法没有统计学差异,对比细胞DNA复制活性发现有限稀释法得到的转基因干细胞活性高于G418药物筛选法得到的转基因干细胞,且细胞生长周期短,由此对过表达细胞系的获取我们采用了有限稀释法获取。Hoxc8基因的敲除载体转染干细胞后对敲除细胞系的获取同时采用有限稀释法和挑单克隆法,结果表明皿挑单克隆法所收集的细胞生长周期较短。对Hoxc8基因过表达细胞系和敲除细胞系Hoxc8基因mRNA和蛋白表达水平进行检测,结果过表达细胞系Hoxc8基因mRNA表达水平是对照组的7倍,基因敲除细胞系没有Hoxc8基因蛋白质的表达。本实验获得了Hoxc8基因高表达和不表达的转基因干细胞系,为以后研究干细胞内Hox家族的代谢调控提供了可靠的细胞模型。二、Hoxc8基因过表达与敲除干细胞的基因差异表达分析对Hoxc8基因过表达细胞系、Hoxc8基因敲除细胞系和对照组细胞进行高通量转录组测序,共获得了142 756 374条Raw Reads。经过数据过滤,获得了137 846 948条Clean Reads。过滤后,样本总序列中,质量值大于30(错误率小于0.1%)的碱基数的比例均为93.3%以上。对Hoxc8基因高表达细胞和对照组细胞进行转录组测序分析,发现细胞样本内共有2 271个差异基因上调表达,5 690个差异基因下调表达(P<0.05);Hoxc8基因敲除细胞和对照组细胞进行转录组测序分析,发现细胞样本中有2 563个差异基因上调表达,有5 413个差异基因下调表达(P<0.05)。上述表达差异基因通过GO功能分析,在基因的分子功能中,细胞器组成、细胞部分和细胞过程三个模块的差异表达基因数量最多。对KEGG中每个信号通路应用超几何检验进行富集分析,发现差异基因同时在两个对比组间均显著富集的通路有肌动蛋白细胞骨架的调控和MAPK通路等共计16条。转录组结果为进一步探究Hoxc8基因在干细胞内的互作基因网络提供了材料和数据。三、Hoxc8基因对干细胞成骨诱导过程的影响脂肪间充质干细胞成骨诱导的过程发现随着成骨标志基因骨钙素(Osteocalcin,OCN)的持续高表达趋势,茜素红染色和碱性磷酸酶染色均为阳性,证明成骨细胞在诱导17 d-21 d时分化形成。Hoxc8基因在诱导过程中期9 d-12 d时,表达量会有明显上升趋势,到诱导晚期表达量又下降到诱导前的水平。结合前期转录组数据发现Hoxc8基因的变化与分节时钟(Segmentation Clock)关联的MAPK信号通路内信号因子密切相关。研究结果为探究Hoxc8基因与乌珠穆沁羊体节发育的关系提供了实验论据。四、分析乌珠穆沁羊全基因组测序数据寻找Hoxc8基因在基因组层面的差异本研究比较了乌珠穆沁羊多脊椎个体和非多脊椎个体的基因组文库,对组间差异区域进行了分析,发现Hoxc8基因在基因组层面上没有发现差异注释区域。但是结合以上转录组测序分析发现Indel差异区域有2个编码区存在差异的基因MDFI和EGFL8与Hoxc8基因变化存在关联性改变的调控关系。