【摘 要】
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尿酸酶（Uricase,EC 1.7.3.3）是生物体内嘌呤代谢过程中的关键酶,能将微溶性尿酸转变为易溶性尿囊素,已用于高尿酸血症及痛风等疾病的治疗。哺乳动物尿酸酶因其与推测出的人源尿酸酶具有高同源性,使其成为尿酸酶类药物的开发重点。半胱氨酸（Cys）可参与二硫键形式,是影响蛋白高级结构和功能的关键氨基酸,哺乳动物尿酸酶蛋白含有4个Cys残基。然而,目前尚无关于哺乳动物尿酸酶游离Cys残基构成形式
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尿酸酶（Uricase,EC 1.7.3.3）是生物体内嘌呤代谢过程中的关键酶,能将微溶性尿酸转变为易溶性尿囊素,已用于高尿酸血症及痛风等疾病的治疗。哺乳动物尿酸酶因其与推测出的人源尿酸酶具有高同源性,使其成为尿酸酶类药物的开发重点。半胱氨酸（Cys）可参与二硫键形式,是影响蛋白高级结构和功能的关键氨基酸,哺乳动物尿酸酶蛋白含有4个Cys残基。然而,目前尚无关于哺乳动物尿酸酶游离Cys残基构成形式及结构功能方面的研究,本论文以犬源尿酸酶（CU）为模板,探究哺乳动物尿酸酶Cys残基的构成形式,并对哺乳动物Cys残基的结构及其对蛋白稳定性的影响进行研究。基于DTNB比色法,我们首次发现以CU为代表的哺乳动物尿酸酶4个Cys残基全部游离,均未参与二硫键形成。将Cys残基封闭后,CU的酶活基本完全丧失,表明Cys残基的氧化还原形式对酶活性有较大影响。因此,我们将CU的4个半胱氨酸（Cys95、Cys141、Cys188、Cys195）分别定点突变为丝氨酸,成功构建突变体C95S、C141S、C188S、C195S工程菌。同时,我们在摇床培养和10 L发酵罐条件下,成功优化发酵工艺,使CU及其突变体的菌体产量高达30 g·L-1,并利用硫酸铵沉淀和黄嘌呤亲和层析分离纯化,得到尿酸酶活性四聚体结构。与CU相比,4个突变体均保留了90%以上的酶活性,表明Cys单个突变不能造成酶活性完全丧失。圆二色谱研究发现Cys残基主要通过影响β-折叠含量,来改变活性四聚体蛋白β-折叠桶的稳定性。通过热稳定性及pH稳定性研究,发现C195S突变体的比活性虽然略低于CU,但其稳定性均显著优于CU,表明Cys突变体酶活性与稳定性之间无必然联系。此外,我们对临近的Cys188和Cys195进行了双突变研究,发现无法获得双突变体C188＆195S的活性四聚体结构,推测Cys188影响亚基间的疏水作用,对Cys188与Cys195可能潜在的相互作用产生影响,进而影响了活性四聚体的形成或稳定性。本论文成功构建了重组尿酸酶大肠杆菌表达体系,建立了重组尿酸酶的发酵和纯化工艺,对哺乳动物犬源尿酸酶的Cys位点进行系统研究,发现Cys位点对哺乳动物犬源尿酸酶结构功能具有重要影响,为哺乳动物尿酸酶结构确认及高稳定性结构筛选改造提供了有益参考。
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