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第一部分：NMDA对大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响
目的:观测体外培养胎鼠海马神经干细胞NMDA受体亚单位的表达情况，并探讨NMDA对神经干细胞增殖以及分化为神经细胞的作用。
方法:
1、从孕18～19d大鼠海马分离神经干细胞(NSCs)，无血清培养基传代培养、单细胞克隆，诱导分化后行Nestin、β-ⅢTubulin和GFAP免疫细胞化学反应鉴定细胞性质和类型。
2、取原代、1代、2代培养处于指数生长期的NsCs进行①NR1、NR2A、NR2B免疫荧光细胞染色；②Western Blot检测NR1、NR2A、NR2B蛋白质的表达；⑨RT-PCR测NR1、NR2A、NR2BmRNA的表达。
3、将传代培养1次NSCs与不同浓度NMDA共同培养3d、7d、12d，MTT法测细胞增殖情况。
4、将传代培养1次NSCs与不同浓度NMDA共同培养3d，用含10％FBS的DMEM/F12诱导贴壁分化，分别于7d、12d行β-ⅢTubulin免疫细胞化学染色。光镜下用网格目镜尺计数细胞数量，以计算神经元的分化比例。
结果:
1、从胎鼠海马分离培养的细胞具有自我更新能力和多分化潜能。表达神经上皮干细胞蛋白(Nestin)，分化后呈β-ⅢTubulin、GFAP免疫反应阳性。
2、1代、2代NSCs NMDA受体亚单位NR1、NR2A、NR2B均呈免疫荧光反应阳性。Western blot结果显示，在115KD、177KD和178KD处出现阳性条带。灰度及统计学分析，显示三种亚单位的光密度值在原代、1代和2代均无明显差异。原代、1代和2代细胞，RT-PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳在402bp、280bp和220bp处出现强荧光条带。
3、MTT结果显示，NMDA作用3d、7d和12d时，100μM NMDA组与正常组OD值相比明显增加(P<0.05)，其它各组与正常组OD值相比差异无统计学意义，各实验组OD值相比差异无统计学意义(P>0.05)。
4、诱导分化7d，12d时，正常组阳性细胞率分别为47.6％，41.5％。在两个时间点各组神经干细胞分化为神经元的比例与相应正常组比较差异无统计学意义，且各组间比较差异也无统计学意义(P>0.05)。
结论:
1、从胎鼠海马分离培养的细胞具备神经干细胞的基本属性，是中枢神经系统的干细胞。
2、早期培养的海马NSCs中NR1、NR2A、NR2B蛋白质和mRNA稳定表达。
3、NMDA浓度为100gM持续作用时，对胎鼠海马NSCs增殖有促进作用。
4、一定条件下，NMDA在浓度为100μM及其以下时，不影响神经干细胞的分化趋势。
第二部分：NMDA受体亚单位2B在海马缺血再灌注损伤中的作用
目的:探讨NMDA受体亚单位2B选择性拮抗剂Ro25-6981对成年大鼠短暂性前脑缺血再灌注海马CA1区损伤神经元保护作用和神经发生的影响。
方法:健康成年雄性SD大鼠(250±25 g)随机分为正常组、假手术组(又分药物组、生理盐水对照组)和缺血再灌注组(又分药物组、生理盐水对照组)。采用四动脉阻断(4AO)大鼠前脑缺血15 min再灌注模型。假手术组和手术组大鼠均于术前30 min腹腔注射不同剂量Ro25-6981(0.3mg/kg、0.6 mg/kg、1.2 mg/kg)、生理盐水(NS)。采用焦油紫、TUNEL染色以及免疫组织化学技术显示再灌注第1d、3d、7d天各组大鼠海马CA1区锥体细胞的构筑及病理改变、细胞凋亡以及BrdU阳性细胞。计数各组大鼠海马CA1区TUNEL、BrdU阳性细胞。
结果:
1、焦油紫结果显示正常大鼠海马锥体细胞境界清楚，排列整齐，胞浆被染成淡紫色，胞核不着色，核仁着色。假手术组细胞形态未见明显改变。短暂性前脑缺血后1d，海马CA1区也未见细胞数量和形态的明显改变。缺血后3d，CA1区出现坏死细胞，特征为体积明显缩小，细胞间隙扩大，细胞固缩呈深紫色。缺血后7d，CA1区坏死细胞体积进一步缩小，呈“米粒”状散在分布在正常细胞之间。
2、短暂性前脑缺血再灌后1d，海马CA1区锥体细胞层出现TUNEL，阳性细胞，为11.33±1.17个/mm<2>，再灌后3d时阳性细胞增多，达到43.33±1.47个/mm<2>，再灌后7d时有所减少。再灌后3d，手术组中注射0.6 mg/kg Ro25-6981组的凋亡细胞数与相应对照组凋亡数相比明显减少(P<0.01)。
3、BrdU阳性细胞胞核为圆形，核染为棕黄色。缺血刺激海马CA1区细胞增殖，1d开始，3d增殖达高峰，BrdU阳性细胞为101.33±5.68个/mm<2>。缺血再灌后，手术组中注射0.3mg/kg和0.6mg/kg Ro25-6981组与相应对照组比BrdU阳性细胞数有所减少(P<0.01)。
结论:
1、一定条件下，Ro25-6981 对缺血诱导的神经元损伤有保护作用。
2、腹腔注射浓度为0.3mg/kg和0.6mg/kg的Ro25-6981可抑制缺血后海马CA1区的神经发生。