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研究目的:本次研究旨在评估莫洛尼小鼠白血病病毒的前病毒插入点(The proviral insertion site in Moloney murine leukemia virus,PIM1)是结肠癌的有效治疗靶点,并探索高车前素(Hispidulin)在结肠癌(CRC)中的抗癌作用及作用机理。研究方法:临床组织样本实验:收集2014年6月至2016年2月期间接受外科手术的63例CRC患者的癌组织和癌旁组织,IHC检测组织中PIM1、Ki-67和Cleaved caspase-3表达;比较CRC组织和癌旁组织中PIM1表达差异;比较不同TNM分期的肿瘤组织中PIM1表达差异;比较淋巴结转移与非淋巴结转移样本中PIM1表达差异;分析Ki-67表达与PIM1表达、Cleaved caspase-3表达与PIM1表达之间的相关性;分析PIM1表达与结肠癌患者的临床病理特征之间的相关性。细胞实验:高车前素以不同浓度(0,10和20μM)和不同时间(24和48 h)分别处理结肠癌HT29和SW480细胞,采用CCK-8法检测各组细胞活力;采用流式细胞仪(Anexxin V/PI双染试剂盒)检测细胞凋亡比率;采用Transwell(Matrigel)检测细胞侵袭能力;利用免疫印迹法检测相关标志物分子的蛋白表达;q RT-PCR检测细胞内PIM1 m RNA表达水平;利用活性氧检测试剂盒检测不同浓度高车前素处理后,HT29和SW480细胞内ROS的水平;PIM1 si RNA、PIM1 vector、JAK2-STAT3通路活化剂(IL-6)和ROS清除剂(NAC)分别用于调控细胞内PIM1表达、JAK2-STAT3通路激活及ROS水平。动物实验:构建结肠癌异体移植肿瘤裸鼠模型和结肠癌肺转移模型分别用于评价高车前素的体内抗肿瘤活性和对肺转移的影响,TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡情况;免疫组化检测肿瘤组织中相关蛋白的表达;HE染色检测肺组织切片的病理变化;并采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。结果:临床组织样本实验:免疫组化结果表明CRC组织中PIM1表达显著高于正常组织,且PIM1表达水平随着CRC患者TNM分期的进展而不断提高;此外,淋巴结转移患者中PIM1表达水平显著高于非淋巴结转移患者;PIM1高表达与Ki-67(细胞增殖标志分子)表达呈正相关,与Cleaved caspase-3(细胞凋亡标志分子)表达呈负相关;与此同时,肿瘤组织中PIM1表达与肿瘤局部浸润和淋巴结转移程度具有显著相关性(p<0.01)。细胞实验:使用PIM1 si RNA抑制PIM1表达(抑制效率为70%)可以显著降低CRC细胞活力、抑制侵袭和诱导细胞凋亡。Western blot实验也验证了此结果:抑制PIM1表达可以显著上调Cleaved caspase-3和Cleaved PARP(细胞凋亡标志分子)的表达,抑制MMP-2和MMP-9(细胞侵袭标志分子)的表达。上述结果表明PIM1在CRC中扮演着原癌基因的作用。CCK-8实验结果表明高车前素可以显著降低CRC细胞活力,此外,高车前素也可以显著抑制细胞侵袭和诱导CRC细胞凋亡;高车前素处理可以剂量依赖性地抑制PIM1 m RNA和蛋白质的表达;使用PIM1 si RNA和PIM1过表达质粒转染CRC细胞后,给予高车前素处理,结果表明高车前素的抗CRC作用可以被PIM1 si RNA增强,被PIM1过表达减弱,由此表明高车前素通过靶向PIM1发挥抗CRC作用。此外,高车前素可以显著抑制p-JAK2和p-STAT3表达;与20μM高车前素组相比,IL-6(50 ng/m L)预处理可以明显减弱20μM高车前素对HT-29和SW480细胞中PIM1蛋白表达的抑制作用(p<0.01);并且高车前素处理可以剂量依赖性地诱导ROS生成;NAC(2 m M)预处理可以显著减弱高车前素对p-JAK2、p-STAT3以及PIM1表达的抑制作用;与20μM高车前素处理组相比,20μM高车前素+IL-6(50 ng/m L)组、20μM高车前素+NAC(2 m M)组均可以显著减弱高车前素对HT29和SW480细胞活力、侵袭、凋亡及相关蛋白表达的影响(p<0.01);我们的结果表明高车前素通过生成ROS,抑制JAK2/STAT3信号通路,下调PIM1表达,进而发挥抗CRC作用。动物实验:体内实验结果也表明高车前素能显著抑制肿瘤生长,减小肿瘤体积和瘤重,增加肿瘤组织中TUNEL阳性细胞数,下调组织中PIM1、p-JAK2和p-STAT3表达(p<0.01)。与对照组相比,40 mg/kg/day剂量的高车前素能显著减少结肠癌的肺转移结节数,且并未造成肺组织病理变化(p<0.01)。结论及意义:PIM1可以被认为是治疗CRC的潜在有效靶点,高车前素通过调控JAK2/STAT3信号通路下调PIM1靶点抑制结肠癌细胞的生长和转移,我们的研究为将高车前素应用于CRC临床治疗提供了实验依据。