论文部分内容阅读
目的:恶性胶质瘤的化疗效果极差,而且化疗耐药性的机制尚不清楚。1.本实验首先利用化疗常用药物顺铂对人胶质母细胞瘤细胞进行诱导,再利用基因芯片技术和生物信息学分析手段鉴定出表达差异最明显的长链非编码RNAAC023115.3,并证实AC023115.3能够通过自噬途径调控顺铂引起的细胞凋亡。2.探究AC023115.3通过调控自噬进而影响顺铂引起的细胞凋亡的具体分子机制,从而阐明一条新的影响胶质瘤化疗耐药性产生的信号通路,为优化胶质瘤的临床治疗提供新思路。方法:1.人胶质母细胞瘤细胞系U87MG经不同剂量的顺铂诱导后,采用Western blot方法检测细胞凋亡相关蛋白表达量的变化,建立耐受不同剂量顺铂的胶质瘤细胞模型;利用基因芯片技术和生物信息学手段筛选出在这些模型中差异表达的长链非编码RNAs(LncRNAs),找出其中表达明显上调的LncRNA(文中称作AC023115.3),然后再用定量PCR(qPCR)的方法对表达水平明显上调的LncRNA(文中称作AC023115.3)进行验证。此外,将U87MG用定量的顺铂处理不同时间,利用qPCR检测AC023115.3表达量的变化是否具有时间依赖性。在U251MG细胞中利用以上的方法检测AC023115.3的表达量变化,并证明这种变化是否具有剂量或时间依赖性。2.在U87MG细胞中使用siRNA敲低AC023115.3的表达水平,随后进行顺铂诱导,利用qPCR和RT-PCR的方法检测AC023115.3表达量变化,用Western blot检测凋亡相关蛋白表达量的变化,流式细胞术检测和分析凋亡细胞的比例变化。相比之下,在U87MG中过表达AC023115.3后用顺铂进行诱导,检测各个指标变化。在U251MG细胞系中采用以上方法检测AC023115.3对细胞凋亡的影响。3.分别在U251MG细胞中过表达或在U87MG细胞中敲低AC023115.3后进行顺铂诱导,用荧光图像观察和分析细胞中LC3点状形成状态,使用Western blot检测细胞中LC3-Ⅱ型蛋白相对于I型蛋白的比例变化,以及p62蛋白表达量的变化,并用透射电镜观察和分析细胞中自噬小体的数量变化,以明确AC023115.3对自噬的调控作用。4.使用靶向自噬相关基因5(atg5)的shrna分别转染u87mg和u251mg细胞后用同等剂量的顺铂进行诱导,随后使用westernblot技术检测自噬及细胞凋亡相关蛋白表达量的变化,同时采用mtt方法评估细胞的生存能力。使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-ma)对u87mg和u251mg细胞后处理后进行顺铂诱导,检测自噬和凋亡相关蛋白表达量的变化,以及细胞生存能力的变化。在u87mg细胞中用共转染ac023115.3的sirna和atg5的shrna后,检测顺铂诱导的细胞凋亡的变化,明确ac023115.3引起的顺铂诱导的细胞凋亡的改变与自噬的关系,同时并使用3-ma进行验证。5.对u87mg和u251mg细胞进行顺铂诱导后使用westernblot检测bcl2家族蛋白表达量的变化,对ac023115.3敲低的u87mg细胞进行顺铂诱导,使用westernblot方法检测mcl1蛋白表达量的变化,用qpcr和rt-pcr检测u87mg细胞中ac023115.3对mcl1mrna表达水平的影响。使用蛋白半衰期实验和泛素化实验检测ac023115.3对mcl1蛋白水平的影响。使用westernblot检测ac023115.3对于mcl1磷酸化水平的影响(ser159位点)。对u87mg和u251mg细胞进行顺铂诱导后使用westernblot检测gsk3β蛋白表达量的变化,随后在u251mg细胞中过表达或在u87mg细胞中敲低ac023115.3后检测gsk3β蛋白表达量的变化。在u87mg细胞中敲低ac023115.3同时过表达gsk3β、在u251mg细胞中过表达ac023115.3同时敲低gsk3β,随后进行顺铂诱导,使用westernblot检测mcl1蛋白表达量的变化。通过以上几方面的实验明确ac023115.3、gsk3β、mcl1之间的调控关系。6.将u87mg细胞顺铂处理后利用qpcr检测gsk3βmrna表达水平的变化。将敲低ac023115.3的u87mg细胞进行顺铂诱导,qpcr检测gsk3βmrna表达水平的变化。利用rip实验检测ago2抗体与ac023115.3结合情况,判断ac023115.3是否与微小rna(mirna)结合,运用lncipedia数据库预测ac023115.3结合的mirnas。对可能性最大的mir-26a利用报告基因实验进行验证。将ac023115.3序列、含有mir-26a结合位点的gsk3β3’utr(非编码区)序列、以及ac023115.3的突变序列分别构建到报告基因载体中,验证mir-26a与ac023115.3是否结合。随后在u87mg和u251细胞中转染含有gsk3β-3’utr序列的载体,顺铂诱导后检测相对荧光素酶活性。在u87mg细胞中转染含有gsk3β3’utr序列的载体,同时敲低ac023115.3或过表达mir-26a后进行顺铂诱导,检测相对荧光素酶活性,使用westernblot检测gsk3β蛋白水平变化。通过在u87mg和u251mg细胞中共转染gsk3β3’utr、mir-26a、ac023115.3进行报告基因实验,阐明ac023115.3、mir-26a和gsk3β三者之间的关系。7.在u87mg中共转染外源性ac023115.3和带有flag标签的mcl1后进行顺铂诱导,使用westernblot检测凋亡及自噬相关蛋白表达量的变化。随后在过表达ac023115.3的u251mg细胞中敲低gsk3β,检测凋亡及自噬相关蛋白表达量的变化。将mir-26a抑制剂或mir-26a模拟物导入u87mg细胞,顺铂诱导后检测凋亡及自噬相关蛋白表达量的变化。在导入有mir-26a抑制剂或mir-26a模拟物的u87mg细胞中过表达gsk3β后进行顺铂诱导,westernblot检测凋亡及自噬相关蛋白表达量的变化。在u87mg细胞中敲低ac023115.3,同时导入mir-26a抑制剂,顺铂诱导后检测凋亡及自噬相关蛋白表达量的变化。在过表达ac023115.3的u87mg细胞中导入mir-26模拟物,顺铂诱导后westernblot检测凋亡及自噬相关蛋白表达量的变化。通过以上几方面的实验,阐明ac023115.3的生物学功能与mir-26a-gsk3β-mcl1信号通路的关系。结果:1.顺铂能促进胶质瘤细胞的凋亡,基因芯片分析显示顺铂引起的差异表达的lncrnas中ac023115.3的表达明显上调,且这种改变与药物剂量或作用时间呈正相关。ac023115.3表达明显上调可减弱胶质瘤细胞顺铂的耐药性。2.westernblot及流式细胞术检测结果显示,在胶质瘤细胞中ac023115.3的表达下调使凋亡相关蛋白的表达降低,凋亡细胞数减少;与此相反,上调ac023115.3的表达可增强凋亡相关蛋白的表达,凋亡细胞数增多。ac023115.3促进顺铂诱导的细胞凋亡。3.细胞荧光实验、westernblot、透射电镜超微结构分析的结果均表明,胶质瘤细胞中ac023115.3表达上调能降低自噬相关关键分子的表达。相反,ac023115.3表达下调能增强自噬相关的关键分子的表达。ac023115.3在顺铂诱导下能够抑制自噬。4.使用自噬相关基因5(atg5)的shrna或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-ma)处理胶质瘤细胞后,顺铂诱导细胞凋亡的能力相对增强,细胞生存力下降。在胶质瘤细胞中,由敲低ac023115.3引起的顺铂诱导的凋亡率的下调可被atg5的敲低或3-ma的使用所逆转。ac023115.3通过抑制自噬来增强顺铂诱导的细胞凋亡。5.westernblot结果显示:胶质瘤细胞用顺铂处理后mcl1的蛋白表达下调,敲低ac023115.3可抑制对mcl1表达的下调作用,提高了mcl1蛋白的稳定性,使顺铂诱导的mcl1的泛素化水平的增强作用被抑制。顺铂可促使mcl1蛋白的磷酸化水平发生变化并可增强gsk3β的表达,gsk3β的表达受ac023115.3正向调控。利用共转染的方法证实了胶质瘤细胞中ac023115.3通过gsk3β下调mcl1的表达。6.ac023115.3对顺铂处理后胶质瘤细胞中的gsk3βmrna表达水平无影响。rna免疫共沉淀实验结果显示ac023115.3可能与mirna发生结合。并通过lncipedia预测和用报告基因实验筛选出可能性最大的mirna(mir-26a)。运用报告基因实验以及共转染的方法证明gsk3β、mir-26a、ac023115.3三者之间存在以下关系,即ac02115.3扮演着mir-26a吸附海绵的角色并促进gsk3β的表达。7.ac023115.3表达上调可以促进胶质瘤细胞中顺铂诱导的凋亡并且降低自噬,但这种作用可被mcl1抑制。gsk3β的下调可抑制ac023115.3所产生的增强凋亡的作用,并能促进自噬。mir-26a抑制剂可增强顺铂诱导的细胞凋亡并减弱自噬,外源性增加mir-26a表达水平可以减弱细胞凋亡并促进自噬;过表达gsk3β可消除mir-26a所发挥的这些作用。mir-26a在顺铂诱导的细胞凋亡和自噬中发挥的生物学功能依赖于gsk3β的表达。8.敲低ac023115.3能抑制顺铂诱导的细胞凋亡并促进自噬;mir-26a抑制剂可消除这些作用。相比之下,增强mir-26a的表达后可削弱ac023115.3过表达所引起的细胞凋亡。综合以上结果,ac023115.3可通过调控mir-26a-gsk3β-mcl1通路来增强顺铂诱导的细胞凋亡并抑制自噬。结论:1.ac023115.3可被顺铂诱导并抑制胶质瘤的化疗耐药性。2.ac023115.3可通过减弱mcl1介导的自噬来促进顺铂诱导的胶质瘤细胞的凋亡。3.ac023115.3扮演着mir-26asponge的角色并抑制其活性。4.AC023115.3通过调控miR-26a-GSK3β-MCL1信号通路增强顺铂诱导的凋亡,提高胶质瘤细胞的化疗敏感性。