论文部分内容阅读
目的:TIPE2能够抑制炎症以及肿瘤的发生发展，并且TIPE2过表达能够促进细胞的凋亡。类风湿关节炎是一种免疫多态性慢性疾病，我们应用类风湿关节炎模型大鼠佐剂型关节炎滑膜成纤维样细胞(fibroblast-like synoviocytes of ratadjuvant arthritis，AA-FLS)，通过体外实验分析TIPE2对死亡受体5诱导细胞凋亡的作用探讨TIPE2对佐剂型关节炎发病的影响。 方法:通过RT-PCR、荧光实时定量PCR和Western-blotting技术检测正常大鼠滑膜成纤维样细胞以及AA-FLS中TIPE2的表达，明确TIPE2在两种细胞系的表达情况。进一步应用慢病毒载体稳定转染AA-FLS，提高TIPE2在AA-FLS的表达并应用荧光显微镜、RT-PCR、荧光实时定量PCR和Western-blotting技术进行鉴定。通过细胞增殖实验以及流式细胞术应用抗DR5单链抗体ZF1研究TIPE2对AA-FLS细胞增殖及凋亡的影响，Western-blotting，caspase8活性检测试剂盒检测相关蛋白的表达，并用caspase抑制剂Z-VAD-FMK以及NF-κB抑制剂Bay同步干扰试验组，然后通过流式细胞术检测凋亡，研究TIPE2调控的可能机制。 结果:通过RT-PCR、荧光实时定量PCR和Western-blotting技术检测发现TIPE2在正常大鼠滑膜成纤维样细胞表达，在AA-FLS中表达明显降低。通过慢病毒载体转染技术，获得TIPE2过表达稳定细胞株TIPE2+/+-FLS以及相应的空载组细胞株MIGR1-FLS。在TIPE2+/+-FLS稳定细胞株中，TIPE2基因水平及蛋白水平的表达都显著上调，TIPE家族其他成员如TIPE1，TIPE3的表达量没有改变。ZF1刺激后，细胞生长抑制率、细胞凋亡率及DR5的表达量以及caspase8的活化量在TIPE2+/+-FLS均有明显的增加，与MIGR1-FLS组相比，差异显著，具有统计学意义;并且TIPE2+/+-FLS磷酸化的NF-κB和磷酸化的AKT明显下调，与MIGR1-FLS组相比，差异显著。在ZF1处理前60min，TIPE2+/+-FLS组给予caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理，MIGR1-FLS组给予NF-κB抑制剂Bay预处理，结果提示caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理的TIPE2+/+-FLS组凋亡率明显降低，其凋亡率与MIGR1-FLS组相当;NF-κB抑制剂Bay预处理的MIGR1-FLS组凋亡率明显提高。 结论:提高TIPE2的表达可以提高ZF1诱导AA-FLS凋亡的敏感性，其机制可能有两点，其一:TIPE2上调AA-FLS膜跨膜蛋白DR5表达上调，激活更多的caspase;其二:抑制NF-κB和AKT的活化。