研究背景机体在遭受疼痛性刺激时产生的超敏反应能够引发不同形式的情绪表现,如:焦虑、恐惧、抑郁等,这些负性情绪对机体的影响比疼痛本身更严重,且能加重机体对疼痛的感知。因此,研究痛和情绪的关系尤为重要。研究者已经证实前扣带皮层吻侧部(rACC)做为脑边缘系统的重要结构,是促成疼痛相关的厌恶情绪的关键区域。因此,了解疼痛相关厌恶情绪的最好的方法是探索rACC内神经信号传导通路及分子机制。我们的研究团队已经证实:rACC神经元BDNF/TrkB信号通路通过激活NR2B受体参与神经病理性疼痛相关厌恶情绪的形成。BDNF/TrkB信号通路激活NR2B受体是否参与炎性疼痛相关的厌恶情绪的形成?BDNF/TrkB信号通路是如何激活NR2B受体发挥作用的?这两个问题激发了我们更深层次的思考和探索。脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白的表达在中枢神经系统明显的升高,它调节神经元活动和控制突触塑形。在海马和其它脑部区域,BDNF是神经元活动诱导长时程增强(LTP)的重要的调制器。在前扣带皮层区(ACC),依赖BDNF的神经元参与了炎性痛相关情绪的形成,是维持和发展慢性炎性痛相关情绪的主要机制。最近Lu-bo等阐述:在前扣带皮层吻侧部(rACC),哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及下游的受动器P70S6K参与了炎性痛相关厌恶情绪的形成。mTOR是重要的细胞内信号中心,它调节细胞的生长、增殖和突触塑形,尤其是控制mRNAs亚单位的翻译。被激活的mTOR能使下游分子p70S6K磷酸化,p70S6K的磷酸化可以做为mTOR激活的标志。文献报道mTOR信号通道调节局部蛋白合成并强化长时程。大鼠足底部皮下注射福尔马林引起的持久的炎性痛过程中,mTOR参与mRNA翻译和局部蛋白合成并发挥重要作用。在神经元树突,当BDNF被激活并参与不同形式蛋白的转录、翻译和转运时,它会触发三个下游信号系统,如:MAPK、PLC、PI3K/mTOR,然后神经元BDNF调控mTOR和它的效应蛋白P70S6K、4E-BP1参与活动。然而,在前扣带皮层吻侧部神经元BDNF和mTOR之间的研究还未曾报道。在神经元的发育过程中,BDNF通过激动mTOR加强NMDA受体NR1和NR3亚单位的局部翻译。文献已经证实:前扣带皮层区神经元NR2B表达的上调,有助于增强外周炎症导致的行为敏化。但是,BDNF、mTOR及NMDA受体NR2B是否存在关系?又是怎样联系在一起的?未曾有报道和文献阐述。总之,我们利用大鼠足底部皮下注射福尔马林导致的炎性疼痛为模型,采用疼痛行为学、Western blot、免疫组织化学和免疫荧光等研究方法,探讨炎性痛觉敏化和炎性痛相关厌恶情绪的形成,以及rACC神经元BDNF、mTOR、NR2B三者之间的关系。第一部分大鼠炎性疼痛导致的痛觉敏化和rACC神经元BDNF的变化目的观察大鼠足底部皮下注射福尔马林后引起的痛觉敏化,以及rACC神经元BDNF表达水平的变化方法采用成年健康200-250g的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,由山东大学实验动物中心提供,动物房温度控制在21℃-23℃,大鼠都能自由饮水和进食,12h-12h昼夜循环光照。饲养一周后分组,随机分为空白对照组(Control组)和福尔马林组(Formalin组)。Formalin组的大鼠左后肢足底部皮下注射50μL 5%福尔马林,而Control组则注射同等剂量的生理盐水。Formalin注射后又分为1天组、7天组、14天组,每组8只。分别在相对应的时间测定各组大鼠的机械痛阈值,测完后将大鼠处死,然后用Western blot、免疫组化和免疫荧光方法检测各组的BDNF蛋白表达情况。结果大鼠足底部机械痛阈值,与Control组13.5±2.3g相比,Formalin 1天组7.8±2.0g,显著降低,差异有统计学意义(P<0.001)。Formalin 7天组足底部机械痛阈值为6.3±2.1g,与Control组比较差异有统计学意义(P<0.001)。Formalin 14天组的机械痛阈值为12.5±2.0g,与Control组比较无统计学意义(P>0.05)。Western blot结果显示,与Control组相比,Formalin 1天组的BDNF表达水平显著增高,两组差异有统计学意义(P<0.001);Formalin 7天组的BDNF表达水平较Control组增高更为明显,差异有显著的统计学意义(P<0.001)。Formalin注射后第14天BDNF表达水平明显降低,差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化和免疫荧光结果显示,与Control组相比,Formalin 7天组BDNF阳性表达数目显著增高,Formalin14天组BDNF阳性表达数目不明显。结论大鼠足底部皮下注射福尔马林能引起痛觉敏化,且能上调rACC神经元BDNF的表达。第二部分rACC神经元BDNF与mTOR之间的关系目的观察rACC神经元BDNF与mTOR之间的关系方法选取成年健康的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重200-250g。按照Paxinos&Watson图谱提供的大鼠脑定位rACC的位置(前囟前2.6mm,中线旁0.6mm,深2.5mm)进行埋管。术后观察5天,行为无异常的大鼠随机分为BDNF组、BDNF拮抗剂组(CTX-B组)、生理盐水组(NS组),在大鼠脑左右两侧rACC区分别给予外源性 BDNF0.5μL(1μg/μL)、CTX-B 0.5μL(10μg/μL)、NS 0.5μL,20分钟后在大鼠的左后肢足底部皮下注射50μL 5%福尔马林,与Control组(左足底部皮下注射50μL生理盐水)和Formalin组(左足底部皮下注射50μL5%福尔马林)比较,共5组每组共8只。结果Western blot 结果显示,与 Control 组比较,BDNF 组、CTX-B 组、Formalin组、NS组的P-mTOR和P-P70S6K蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.001),这提示福尔马林诱导的炎性痛上调mTOR蛋白的表达。而BDNF组、CTX-B组和Formalin组这三组比较中,与Formalin组比较,BDNF组能够显著上调mTOR的蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.001);而CTX-B组则显著的抑制mTOR的蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.001),这提示BDNF神经元能够激动mTOR受体的表达。免疫组化和免疫荧光结果显示,与Control组比较,BDNF组的P-mTOR蛋白表达的阳性数目显著增多,而CTX-B组的P-mTOR蛋白表达的阳性数目不明显。结论大鼠足底部皮下注射福尔马林引起的炎性痛过程中,rACC神经元BDNF激动mTOR的表达。第三部分rACC神经元mTOR对炎性疼痛相关的厌恶情绪的影响目的观察rACC神经元mTOR与炎性痛相关的厌恶情绪之间的关系方法选取成年健康的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重200-250g。按照Paxinos and Watson图谱里提供的大鼠脑定位rACC的位置(前囟前2.6mm,中线旁0.6mm,深2.5mm)埋管。术后观察5天,行为无异常的大鼠随机分为:足底部皮下接受福尔马林(50μL 5%)注射的雷帕霉素组(RAPA组)和雷帕霉素对照组(DMSO组);足底部接受电击(0.5mA,2s)刺激的雷帕霉素组(RAPA组)和雷帕霉素对照组(DMSO组);每组大鼠都要经过条件位置回避训练(CPA)实验:第1-2天是CPA训练前阶段,第3-4天是CPA条件训练阶段,第5天是CPA测试阶段。大鼠足底部皮下注射福尔马林或电击前20分钟,两侧rACC区注射雷帕霉素0.5μL(7ng),对照组给予相同剂量的DMSO,每组共8只。根据大鼠训练前后在条件室回避的时间差值判断产生炎性疼痛相关情绪的情况。结果足底部皮下注射福尔马林的大鼠,实验结果发现,DMSO组的大鼠在训练前滞留条件室的时间为483.0±37.2s,训练后为230.0±28.3s,训练前后差异有显著的差别(P<0.001),该结果表明大鼠在条件室形成了条件位置回避。然而,脑rACC内注射RAPA的实验组大鼠,在训练前滞留条件室的时间为495.0±39.4s,训练后为475.0±24.2s,训练前后差异无明显差别(P>0.05),该结果表明,脑rACC内注射RAPA后的大鼠不能形成条件位置回避。因此,与DMSO组大鼠CPA数值(253.3±23.4s)比较,RAPA实验组大鼠的CPA数值(20±20s)显著降低,两者之间的差异具有明显的统计学意义(P<0.001),该结果表明,阻断mTOR受体就能阻止大鼠的条件位置回避的形成,大鼠脑rACC神经元mTOR是形成炎性痛相关的厌恶情绪所必需的条件。足底部接受持续电击的大鼠,实验结果发现,DMSO组的大鼠在训练前滞留在条件室的时间为498.0±39.7s,训练后200.0±36.3s,训练前后差异有显著的差别(P<0.001),该结果表明,DMSO组的大鼠出现了条件位置回避现象。RAPA实验组大鼠,在训练前滞留条件室的时间为495.0±47.6s,训练后220.0±28.3s,训练前后差异有显著的差别(P<0.001),该结果表明,RAPA组的大鼠也形成了条件位置回避。因此,与DMSO组的CPA数值(238.3±21.4s)比较,RAPA实验组大鼠的CPA数值(275.0±28.8s)无显著的差异,两组之间的差别无统计学意义(P>0.05),该结果表明,阻断mTOR受体无法阻止恐惧刺激诱发的条件位置回避的形成,结论rACC神经元mTOR的激活是炎性痛相关的厌恶情绪生成所必需的。第四部分BDNF/mTOR信号通路对神经元NR2B的影响目的观察rACC内BDNF/mTOR信号通路与NR2B之间的关系方法选取成年健康的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重200-250g。按照Paxinos&Watson图谱里提供的大鼠脑定位rACC的位置(前囟前2.6mm,中线旁0.6mm,深2.5mm)埋管。术后观察5天,行为无异常的大鼠随机分为CTX-B组、生理盐水组(NS组)、雷帕霉素组(RAPA组)、雷帕霉素的对照组(DMSO组),在大鼠脑部左右两侧rACC区分别注射外源性BDNF的拮抗剂CTX-B 0.5μL(10μg/μL)、NS 0.5μL、mTOR 的拮抗剂雷帕霉素 0.5μL(7ng)、DMSO 0.5μL(1%),20分钟后大鼠足底部皮下注射50μL5%福尔马林,与Control组(足底部皮下注射50μL生理盐水)和Formalin组(足底部注射50μL5%福尔马林)比较。在福尔马林注射后第7天处死大鼠,用Western blot方法、免疫组化和免疫荧光方法检测 rACC 神经元 NR2B 在 Control 组、Formalin 组、NS 组、CTX-B 组、RAPA组、DMSO组的表达,每组共8只。结果Western blot结果显示,与Control组比较,Formalin组NR2B的表达显著升高(P<0.01),这就说明了福尔马林诱发的炎性疼痛上调了 NR2B的表达;与Formalin组比较,CTX-B组和RAPA组NR2B的表达显著降低(P<0.001),而对照组NS和DMSO的NR2B的表达无明显的差异(P>0.05),这就说明了阻断BDNF/mTOR信号通路能够抑制NR2B的表达。免疫组化和免疫荧光的结果显示,与Formalin组比较,CTX-B组和RAPA组NR2B的阳性数目表达显著减少。结论rACC内BDNF/mTOR信号通路能够上调NR2B的表达。研究意义本研究以大鼠的炎性疼痛模型为基础,采用疼痛行为学、分子生物学以及条件位置回避实验的方法,发现炎性痛不但引起痛觉敏化和痛相关的厌恶情绪,而且上调rACC神经元BDNF、mTOR和NR2B的表达,进一步的探讨和实验研究之后,我们发现BDNF通过激活mTOR上调NR2B的表达,mTOR的激活是炎性痛相关厌恶情绪生成所必需的。我们的发现可能加快炎性疼痛相关的情绪障碍的研究,并为将来的慢性疼痛治疗提供新的见解。