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研究目的1)探讨1,25-(OH)2维生素D3对hBMSCs成脂过程中PPAR-y通路的影响。2)探讨1,25-(OH)2维生素D3对hBMSCs成骨过程中Hedgehog/Gli1、 Wnt/β-catenin、TGF-β/BMP2、Notch1等通路的影响。3)探讨维生素D3在体外对钙结节的形成作用及体内对对血清骨代谢指标的影响。研究方法1.1,25-(OH)2维生素D3对hBMSCs成脂过程中PPAR-y通路的影响：1) hBMSCs的分离培养及成脂诱导鉴定：人骨髓间充质干细胞取材、分离、培养,通过贴璧筛选法建立hBMSCs的体外培养体系,镜下观察细胞成长梭形贴壁生长,符合骨髓间充质干细胞形态及生长特点；分别于加入成脂诱导液诱导7天和14天时,油红O染色观察脂肪颗粒的形成。2)不同浓度1,25-(OH)2维生素D3对hBMSCs成脂过程中PPAR-y通路表达的影响：鉴定成脂诱导成功后,取处于对数生长期的P2-P3代hBMSCs,在相同条件下,分为成脂诱导液对照组、成脂诱导+10-8mol/L VitD3组、成脂诱导+10-10mol/L VitD3组、成脂诱导+10-12mol/L VitD3组干预诱导成脂过程,诱导5天时,用定量PCR方法检测各组PPAR-y mRNA的表达水平,用Western blot方法检测各组PPAR-y蛋白表达水平。组间比较采用单因素方差分析(正态分布时)或非参数检验(非正态分布时),P<0.05视为差异有统计学意义。2.1,25-(OH)2维生素D3对hBMSCs成骨过程中Hedgehog/Gli1、Wnt/β-catenin、 TGF-β/BMP2. Notchl等通路的影响。1) hBMSCs的分离培养和及成骨诱导鉴定：人骨髓间充质干细胞取材、分离、培养,通过贴壁筛选法建立hBMSCs的体外培养体系,镜下观察细胞成长梭形贴壁生长,符合骨髓间充质干细胞形态及生长特点；加入成骨诱导液诱导21天,用茜素红s染色观察钙结节的形成。2)不同浓度1,25-(OH)2维生素D3对hBMSCs成骨过程中Hedgehog/Glil、 Wnt/p-catenin、TGF-β/BMP2、Nocth1等通路表达的影响：鉴定成骨诱导成功后,取处于对数生长期的P2-P3代hBMSCs,在相同条件下,分为成骨诱导组、成骨诱导+10-5mol/L VitD3组(高浓度组)、成骨诱导+10-7mol/L VitD3组(中浓度组)、成骨诱导+10-9mol/L VitD3组(低浓度组)干预成骨诱导过程,诱导7天时,用定量PCR方法检测各组Gli1mRNA、β-catenin mRNA、BMP2mRNA、Notch1mRNA的表达水平,用Western blot方法检测各组Gli1、p-catenin、BMP、Notch1蛋白的表达水平。组间比较采用单因素方差分析(正态分布时)或非参数检验(非正态分布时),P<0.05视为差异有统计学意义。3.观察维生素D3对钙结节形成的影响及服用维生素D3后对血清骨代谢指标的影响：取生长良好的P2-P3代hBMSCs,用不含任何成骨成份的hBMSC培养基培养,分为普通培养液对照组、普通培养液+10-5mol/L VitD3组、普通培养液+10-10mol/L VitD3组,培养21天后茜素红染色观察有无钙结节形成。另外给具有骨质疏松症潜在危险因素的口服维生素D30.25μg/天,治疗时间3-12个月不等,测量治疗前后患者体内血清25(OH)D3、PTH、β-CT及N-MID的水平。各指标的比较采用两相关样本的非参数检验,P<0.05视为差异有统计学意义。结果1.1,25-(OH)2维生素D3对hBMSCs成脂过程中PPAR-y通路的影响：1)体外培养所得人骨髓间充质干细胞,经成脂诱导液诱导后可见脂肪颗粒形成,证明成脂诱导有效。2)1,25-(OH)2维生素D3对PPARy的影响：用定量PCR检测显示,加入10-8mol/L VitD3组PPAR-γ mRNA的表达量较未加入VitD3的单纯成脂诱导组减少,差异有统计学意义(P值0.042)；用Western blot检测显示：加入10-8mol/L VitD3组PPAR-γ蛋白的表达量较成脂诱导组减少,差异同样具有统计学意义(P值0.032)。2.1,25-(OH)2维生素D3对hBMSCs成骨通路的影响1)体外培养所得细胞形态符合人骨髓间充质干细胞,经成骨诱导液诱导后可见钙结节形成,证明成骨诱导有效。2)1,25-(OH)2维生素D3成骨通路的影响：用定量PCR检测显示：加入高、中浓度VitD3组Glil mRNA及Notch1mRNA的表达量均较单纯成骨诱导对照组增多,差异有统计学意义(P值分别为0.018、0.028及0.006、0.016)；加入高浓度VitD3组β-catenin mRNA及BMP2mRNA的表达量较单纯成骨诱导对照组增多(P值0.035及P值0.009)。用Western blot检测显示：加入高浓度VitD3组Gli1蛋白的表达量较成骨诱导对照组组增多(P值0.009)；加入高、中浓度VitD3组P-catenin蛋白、BMP2蛋白、Notch1蛋白的表达量均较单纯成骨诱导组均增多,差异同样具有统计学意义(P值分别为0.014、0.03/0.003、0.015/0.007、0.043)。3.维生素D3对骨代谢的影响：1)用不含任何成骨成份的培养基培养21天后,加入+10-5mol/LVitD3组及10-10mol/L VitD3组均可使hBMSC形成钙结节,而未加入VitD3的普通培养液对照组无钙结节形成。2)服用维生素D3治疗后,血清25(OH)D3水平较治疗前升高,β-CT水平较治疗前下降,差异均有统计学意义(P值分别为0.001及0.000)；而PTH及N-MID在治疗前后无明显差异。结论1.有效浓度的1,25-(OH)2VitD3可以抑制成脂诱导过程中PPAR-γ的表达,从而抑制hBMSCs向脂肪细胞分化；2.有效浓度的1,25-(OH)2VitD3可增强成骨诱导过程中Hedgehog/Glil、 Wnt/β-catenin、TGF-β/BMP及Notchl途径的表达,从而增强hBMSCs向成骨细胞分化；3.单独使用1,25-(OH)2VitD3可以诱导hBMSCs形成钙结节,并可降低患者的β-CT水平,减少骨吸收。