美国癌症协会公布2019年美国前列腺癌发病率超过肺癌,位于男性肿瘤第一位,死亡率高居第二位。近十年来,随着人群饮食结构及生活方式的西化,我国前列腺癌的发病率、死亡率逐年递增,严重威胁老年男性的身心健康。自1941年首位前列腺癌患者接受去势手术治疗以来,雄激素剥夺疗法（Androgen Deprivation Therapy,ADT）已成为前列腺癌治疗的经典疗法。超过80%的患者在肿瘤早期阶段接受雄激素剥夺治疗后临床疗效显著,但多数患者在经历14-30个月的治疗敏感期后,病变将逐步发展为雄激素非依赖状态,即去势抵抗性前列腺癌（Castration-resistant Prostate Cancer,CRPC）。CRPC期患者的中位生存期十分短暂,逐渐成为晚期前列腺癌患者死亡的主要原因之一。由此可见,深入研究前列腺癌激素依赖状态改变的机制,寻找高效的治疗措施,对于延缓肿瘤恶性进展以及提高患者生存率意义重大。近年来,不同类型RNA分子在肿瘤中发挥的作用得到广泛研究。长链非编码RNA（LncRNA）作为一种由200个以上核苷酸分子构成的非蛋白编码转录本,广泛参与到细胞增殖、分化、凋亡、DNA损伤反应以及染色体印记等多个生物学过程。根据亚细胞定位不同,LncRNA可在细胞核中与RNA、DNA结合,调节染色质修饰和pre-mRNA的剪切,抑或充当蛋白复合物组装的支架结构,同时也可在细胞质中发挥分子海绵吸附作用,调节转录产物的翻译及稳定性,从而影响细胞信号传导级联。雄激素受体（AR）作为配体响应性蛋白,可介导前列腺癌（PCa）中雄激素的效应功能。众所周知,即使在雄激素剥夺治疗以后,异常激活的AR对于PCa细胞的存活和CRPC的进展必不可少,而在对AR信号通路再激活的机制研究中,越来越多的证据表明LncRNA可通过招募特定转录因子的共激活因子调控AR下游基因的表达,在激素依赖状态的转变中发挥至关重要的作用。RNA解旋酶DDX5（p68）属于DEAD box家族,具有依赖于RNA的ATPase活性,参与调控RNA的剪切、翻译。p68作为AR的共激活因子,与AR共同结合在AR下游基因启动子区域的顺式调控元件（AU-rich element,ARE）上,促进AR通路下游基因的表达,激活AR信号通路,促进肿瘤的恶性进展。本课题组通过结合激素依赖性前列腺癌（ADPC）患者组织标本、去势抵抗性前列腺癌（CRPC）患者组织标本、远处淋巴结转移患者转移性淋巴结组织标本以及前列腺癌生物学信息数据库发现LncRNA CCAT1在CRPC以及远处转移淋巴结组织中显著高表达,并且在CRPC细胞系（PC3、Du145）中表达量显著增加,由此提示CCAT1可能与CRPC的进展密切相关。CCAT1定位于人类染色体8q24.21,首先发现高表达于结肠癌中,在其他如肝癌、胃癌、胆囊癌、肺癌、卵巢癌以及食管鳞癌的肿瘤组织中均存在异常的表达,而目前关于CCAT1在前列腺癌中的表达及功能知之甚少。基于此研究现状,本研究首先在PCa的细胞和组织中明确CCAT1的表达,随后分离细胞核、质组分并提取各组分RNA进行实时荧光定量PCR检测CCAT1的亚细胞结构定位,并借助体内外功能实验探讨CCAT1异常表达对PCa细胞生物学功能的影响。最后结合生物信息学分析及分子机制研究进一步明确CCAT1在PCa进展中发挥重要生物功能的机制,为前列腺癌诊断及治理靶点的寻找奠定坚实的基础。第一部分CCAT1在前列腺癌组织及细胞中的差异表达研究目的:近十年来,伴随我国日益加剧的老龄化社会进程,前列腺癌的发病率、死亡率逐年递增。前列腺癌早期,肿瘤多为激素依赖性（ADPC）,雄激素剥夺疗法可显著延缓肿瘤进展。但在经历14-30个月的敏感阶段后,多数肿瘤将转变为雄激素非依赖状态,被称为激素抵抗性前列腺癌,即CRPC。一旦患者病情进入激素抵抗阶段,由于缺乏长期有效的药物以及肿瘤对放化疗缺乏敏感性,多数患者中位生存时间小于20个月。随着人类基因组计划测序的完成,众多被认为是“转录噪声”的非编码RNA被证实可以参与调控细胞的增殖、凋亡、分化、代谢以及个体的发育和肿瘤的发生发展。LncRNA作为一种相对较长的非编码RNA分子可形成复杂的RNA二级结构,结合RNA、DNA或蛋白调控它们的功能,参与编码基因的转录和肿瘤的发生发展。本阶段研究通过RNA原位杂交（In situ hybridization,ISH）以及荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）分析在不同阶段前列腺癌患者组织标本、细胞系中CCAT1的表达,并结合细胞核、质分离实验明确其亚细胞结构定位,综合评估CCAT1与前列腺癌临床发病及预后相关性。研究方法:临床收集8例ADPC患者与4例CRPC患者术后肿瘤组织样本,通过RNA ISH分析CCAT1在不同阶段前列腺癌组织中的表达情况,采用细胞核、质分离结合实时荧光定量PCR（quantification real-time PCR,qRT-PCR）以及FISH明确CCAT1在前列腺癌细胞系中的表达与定位。运用统计学方法对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）、纪念斯隆-凯瑟琳癌症中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center,MSKCC）数据库中前列腺癌患者的LncRNA基因芯片数据二次分析,明确CCAT1在前列腺癌中的表达及与肿瘤患者的预后、生化复发的相关性。研究结果:通过RNA ISH、qRT-PCR发现,相比于ADPC组织及细胞系（LNCaP）而言,CCAT1在CRPC组织、细胞系（PC3、Du145）及远处转移淋巴结组织表达显著上升（P<0.05）。亚细胞结构定位、FISH显示CCAT1可同时分布在ADPC细胞系（LNCaP）的细胞核与细胞质中;而CCAT1的细胞质定位则主要存在于ADPC细胞系（Du145）中。综合分析TCGA数据库中前列腺癌患者基因芯片,结果显示随着肿瘤恶性程度增加,CCAT1的表达水平逐渐上升（P<0.05）,远处转移组织中CCAT1的表达也显著高于局部转移性肿瘤（P<0.001）。进一步分析MSKCC数据库前列腺癌患者的术后生存资料并绘制Kaplan–Meier生存曲线,结果提示在一组随访时间超过12个月的115例前列腺癌患者中,以纳入人数的前1/4为截点将115例患者分为CCAT1低表达组和CCAT1高表达组,CCAT1高表达组的83例患者的生化复发时间明显早于CCAT1低表达组的32例患者;同样的,对另一组150例随访患者生存情况分析发现,以纳入人数的前1/4为截点将150例患者分为CCAT1低表达组和CCAT1高表达组,CCAT1高表达组的109例患者总体存活率显著低于CCAT1低表达组的约41例患者。研究结论:上述研究结果提示CCAT1在CRPC组织及细胞系中的表达显著高于ADPC,此外,表达上升的的CCAT1与前列腺癌患者的不良预后密切相关。亚细胞结构的不同定位,提示CCAT1可能通过不同的调节机制,参与前列腺癌的恶性进展过程。第二部分CCAT1对前列腺癌细胞生物学功能的影响研究目的:前列腺癌的恶性进展是一个连续渐进的多因素、多步骤动态过程,共激活因子、染色质修饰酶以及AR剪切变异体等众多调控分子相互作用,共同促进肿瘤细胞激素依赖状态的转变。本研究的第一部分中,RNA ISH、qRT-PCR提示CCAT1在CRPC组织、细胞和远处转移淋巴结组织中的表达与ADPC组织和细胞中相比显著上升,亚细胞定位结果表明CCAT1在不同前列腺癌细胞系中定位不同,对肿瘤基因表达数据库中前列腺癌患者LncRNA芯片结果的二次分析揭示CCAT1与前列腺癌的预后密切相关。以上结果均在一定程度上证实了CCAT1可能参与ADPC向CRPC转化的过程。但目前就CCAT1在人前列腺癌中发挥的具体作用尚无系统的功能学实验研究。因此,CCAT1是否参与前列腺癌的恶性进展,在细胞激素依赖状态转化的过程中扮演着怎样的角色,值得进一步深入研究探讨。本部分研究中,通过体内外构建异常表达CCAT1的细胞及裸鼠模型,我们探讨了CCAT1在ADPC和CRPC细胞中对细胞增殖能力、细胞周期进展、凋亡细胞比例以及裸鼠皮下成瘤能力的影响,初步对CCAT1影响的细胞功能学通路进行了总结。研究方法:通过体外功能实验分别在激素依赖性前列腺癌细胞系（LNCaP）中过表达以及在去势抵抗性前列腺癌细胞系（PC3和Du145）中干扰CCAT1表达后,采用CCK8细胞增殖和低密度细胞克隆形成实验检测CCAT1对前列腺癌细胞增殖的影响;流式细胞检测CCAT1对前列腺癌细胞周期进程以及细胞凋亡能力的影响;通过慢病毒转染构建稳定低表达CCAT1的PC3细胞系,对CCAT1低表达介导的基因谱改变进行基因富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）和功能分类分析（Gene Ontology annotation,GO）;Western Blot验证相关通路的基因变化。体内实验采用裸鼠皮下成瘤模型,验证CCAT1对PC3细胞系成瘤能力的影响,通过免疫组化（IHC）检测实验组（低表达CCAT1）、对照组肿瘤样本中Ki-67、Caspase-3基因的表达情况,进一步证实CCAT1对前列腺癌细胞系增殖及凋亡的影响。研究结果:体外分别构建稳定高、低表达CCAT1的前列腺癌细胞系后,CCK8实验和低密度克隆形成实验结果表明在CCAT1表达量相对较低的激素依赖性细胞系LNCaP中过表达CCAT1后,相比于对照组（NC组）,实验组（CCAT1组）细胞增殖及克隆能力显著增加（P<0.05）;流式细胞检测结果显示过表达CCAT1能够促进细胞周期进程（P<0.05）,降低凋亡细胞所占比例（P<0.05）。Western Blot证实CCAT1组与NC组相比,细胞周期素依赖性激酶抑制因子p21蛋白、肿瘤抑制基因p53蛋白表达显著降低。同时在CCAT1表达量相对较高的激素非依赖性细胞系PC3、Du145中干扰CCAT1表达后,相比于照组（si NC组）,实验组（siCCAT1组）细胞增殖及克隆形成能力显著降低（P<0.05）;流式细胞检测发现干扰CCAT1表达能够延缓细胞周期进程（P<0.05）,增加凋亡细胞所占的比例（P<0.05）。Western Blot证实siCCAT1组与si NC组相比,p21蛋白和p53蛋白表达明显增高。体外实验结果提示CCAT1在前列腺癌中发挥一定促癌基因的功能。体内实验的裸鼠皮下成瘤模型结果表明,干扰CCAT1表达后,PC3细胞的成瘤能力降低,皮下种植瘤的瘤体增殖速度和体积明显小于对照组（P<0.05）。皮下肿瘤进行病理切片后,IHC结果提示siCCAT1组肿瘤中细胞增殖基因Ki-67表达降低,而细胞凋亡相关基因Caspase-3则明显增高。对干扰CCAT1所介导的富集通路和基因功能相关改变进行分析,结果提示DNA修复过程以及p53细胞凋亡信号通路与CCAT1表达的降低密切相关。研究结论:以上体内外功能实验研究结果表明CCAT1的高表达能够促进前列腺癌细胞增殖、细胞周期进展,并抑制细胞凋亡。相反,CCAT1表达受到干扰后,前列腺癌细胞的增殖、细胞周期进展受到明显的抑制,凋亡细胞比例增高。结合CCAT1表达下降后相关信号通路的改变,可以得出结论,CCAT1在前列腺癌中发挥了促癌基因的作用。第三部分CCAT1靶向结合miR-28-5p逆转肿瘤抑制效应研究目的:第二部分体内外功能学实验结果证实CCAT1高表达可促进前列腺癌细胞增殖和细胞周期进程,减少肿瘤细胞凋亡,而低表达可抑制肿瘤细胞增殖以及细胞周期进程,增加凋亡细胞比例,从而在前列腺癌恶性进展中发挥促癌基因的功能。但CCAT1参与前列腺癌恶化的分子机制目前尚未明确,仍需更加深入的研究。根据上文阐述,LncRNA在不同亚细胞结构中可以通过不同的作用方式参与到肿瘤的发生发展过程中。在细胞质中,LncRNA可以通过与mRNA的3’UTR双链体结合或竞争性结合miRNA反式激活下游靶mRNA的衰变,调节细胞质中miRNA靶标基因的表达;而在细胞核中,LncRNA又可通过不同的作用机制影响mRNA的功能。因此,在明确了CCAT1的促癌功能后,其分子作用机制将是我们探讨的重点。研究方法:通过体外逆转录构建生物素标记的CCAT1-sense与CCAT1-antisense的单链RNA,经折叠形成RNA二级结构后,将CCAT1-sense和CCAT1-antisense与前列腺癌细胞裂解产物孵育后进行RNA-seq分析,发现miR-28-5p是CCAT1在前列腺癌中潜在的竞争性结合靶miRNA分子。根据CCAT1亚细胞定位的不同,我们在Du145细胞中通过双荧光素酶报告基因（Dual luciferase reporter assay）、qRT-PCR实验验证CCAT1与miR-28-5p相互关系,并通过一系列细胞功能学和功能回复实验,进一步证实CCAT1与miR-28-5p之间的相互作用。研究结果:构建生物素标记的CCAT1-sense和antisense后,体外RNA pulldown实验结合RNA-seq结果显示miR-28-5p均出现在CCAT1-sense和CCAT1-antisense两组RNA的富集产物中,且富集程度存在显著差异（P<0.05）;Dual luciferase reporter assay、qRT-PCR实验结果均提示CCAT1可直接与miR-28-5p相互结合,CCAT1低表达可提高细胞内的miR-28-5p表达水平,而miR-28-5p的高、低表达亦可减少或增加细胞内CCAT1的表达水平。对miR-28-5p的功能学研究发现,miR-28-5p可作为肿瘤抑制因子,在前列腺癌细胞增殖过程中发挥抑癌基因作用,进一步的功能学回复实验则说明干扰CCAT1表达后,下调细胞内miR-28-5p的表达可部分逆转CCAT1表达量降低对肿瘤增殖产生的抑制效应。上述实验更加进一步证实了CCAT1与miR-28-5p的直接相互作用。研究结论:CCAT1可与miR-28-5p直接结合,逆转miR-28-5p的肿瘤抑制效应,从而发挥促进前列腺癌细胞增殖的生物学功能。第四部分CCAT1招募AR共激活因子DDX5参与前列腺癌恶化的机制研究研究目的:在第三部分中,通过构建体外RNA分子逆转录体系结合RNA分子间相互作用的机制研究,证实了CCAT1可以在前列腺癌细胞质中靶向结合miR-28-5p这一肿瘤抑制基因,促进前列腺癌的恶性进展。如前所述,除了在细胞质中发挥分子海绵吸附作用,LncRNA还可在细胞核中桥接不同分子形成核蛋白复合体,调控基因的表达。第一部分的研究结果提示CCAT1在不同前列腺癌细胞系中亚细胞的定位存在不同,说明除了在细胞质中作为竞争内源性RNA（competing endogenous RNA,ce RNA）促进前列腺癌的恶性进展外,CCAT1还可能在细胞核中通过募集调控分子,充当蛋白复合体的支架结构促进CRPC的发展进程。因此,对于CCAT1在细胞核中发挥的促癌作用及机制值得我们更加深入的探讨。研究方法:体外逆转录构建生物素标记的CCAT1-sense与CCAT1-antisense单链RNA并经折叠形成RNA二级结构后,将CCAT1-sense和CCAT1-antisense与前列腺癌细胞核裂解产物共同孵育并进行差异性富集蛋白定性检测分析,通过Western Blot、蛋白电泳凝胶银染以及RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）验证与CCAT1-sense和antisense差异性富集的蛋白分子;通过染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP）结合qRT-PCR验证高、低表达CCAT1后,被RNA解旋酶DDX5（p68）和AR共同募集的PSA不同片段是否存在相应的增加或减少;qRT-PCR、Western Blot验证CCAT1的异常表达是否引起AR下游靶基因PSA、hNKX3.1以及AR调节的去势抗性基因UBE2C的表达发生相应改变;细胞功能学验证CCAT1的促癌作用是否会被表达下调的p68逆转。研究结果:体外RNA pulldown实验结合富集蛋白定性检测,我们发现CCAT1 sense对p68蛋白的富集程度显著高于CCAT1 antisense,Western Blot、蛋白电泳凝胶银染、RIP实验也证实了CCAT1 snese对p68蛋白的高度富集。Ch IP assay、qRT-PCR证实过表达CCAT1后,由p68和AR共同募集的PSA不同片段的表达相应增加（P<0.05）,干扰CCAT1的表达,募集的PSA不同片段表达相应减少（P<0.05）;qRT-PCR、Western Blot证实随着CCAT1表达增加,AR下游靶基因PSA、hNKX3.1以及AR调节的去势抗性基因UBE2C的表达上升（P<0.05）,而CCAT1的表达降低可以减少PSA、hNKX3.1和UBE2C的表达水平（P<0.05）。CCK8细胞增殖实验、低密度细胞克隆形成实验表明在CCAT1过表达的LNCaP细胞中,干扰p68蛋白表达可抑制CCAT1对细胞增殖的促进作用（P<0.05）,流式细胞凋亡检测提示,在CCAT1过表达后减少细胞内p68蛋白表达水平,可以增加凋亡细胞的比例（P<0.05）。研究结论:以上研究结果表明在前列腺癌细胞核中,CCAT1可以招募p68与AR定位于AR通路靶基因PSA的不同片段上,提高AR信号通路基因PSA、hNKX3.1以及AR调控的去势抵抗基因UBE2C的表达水平,异常激活AR信号通路,促进前列腺癌的恶性进展与CRPC的转化。