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猪δ冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是近年来新发现的可引起猪只,特别是新生仔猪腹泻的冠状病毒,其引发的腹泻具有较高的发病率和死亡率,是造成新生仔猪死亡的重要原因之一。猪Delta冠状病毒,属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。PDCoV在2012年报道后,陆续在美国、中国等出现。目前对于PDCoV的致病和复制机理尚不清楚,仅了解其引起仔猪发病特征与猪流行性腹泻病毒相似。鉴于PDCoV在猪群中的广泛流行性及潜在威胁,本试验建立了针对PDCoV核酸的RT-PCR(Reverse Transcriptional Polymerase Chain Reaction)和反转录环介导等温扩增(Reverse Transcriptional Loop-Mediated Isothermal Amplification,RT-LAMP)的检测方法及针对PDCoV抗体的间接ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)的检测方法。1.PDCoV RT-PCR方法的建立及其流行病学调查比对GenBank中PDCoV全基因序列,根据其保守区域设计一对特异性扩增N基因片段的引物,利用RT-PCR方法扩增获得329 bp的片段,与预期目的片段大小一致,扩增产物经克隆后测序,将获得的序列与GenBank数据库序列进行比对,比对结果表明试验所获得的序列与数据库中PDCoV序列的同源性高达99.1%,证明所扩增的序列属于PDCoV;对建立的RT-PCR方法的特异性、敏感性、稳定性鉴定,结果表明该方法的特异性好、敏感性高、稳定性强;应用建立的RT-PCR方法检测了656份2012—2017年采集自江西省各地区的腹泻母猪粪便及腹泻仔猪粪便/肠道样本,结果显示腹泻样本中PDCoV的检出率为30.79%(202/656),母猪粪便中PDCoV的检出率(27.78%)稍低于仔猪粪便及肠道样品PDCoV的检出率(30.97%),最早可从2012年的样品中检测出PDCoV。2.PDCoV RT-LAMP检测方法的建立根据比对结果,选取PDCoV N基因全长为目标序列,设计2套RT-LAMP引物。以PDCoV阳性病料提取的总RNA为模板,建立了PDCoV RT-LAMP的检测方法。对反应条件优化后,结果表明该反应的最佳条件是63℃恒温水浴70min,且该方法灵敏度高,特异性好。应用RT-LAMP、RT-PCR和套式RT-PCR对192份临床样品进行检测,结果表明RT-LAMP的灵敏度为RT-PCR的100倍,与套式RT-PCR相当。3.PDCoV N基因的原核表达以PDCoV阳性病料提取的总RNA为模板,扩增PDCoV N基因的全基因序列,扩增片段经双酶切后与表达载体pColdⅠ连接,构建重组表达质粒pCold-PDCoV-N,将重组质粒转入BL21(DE3)感受态细胞,OD600nm值为04-0.6时,冰浴30min后加入终浓度为0.8mM IPTG,15℃诱导表达21 h,破碎菌体得到大小约为41kDa的重组蛋白,且蛋白主要以可溶性的形式存在。使用PDCoV阳性血清作为一抗进行Western Blot试验,结果表明其免疫原性良好。4.PDCoV间接ELISA检测方法的建立以纯化的PDCoV N重组蛋白为包被抗原,采用棋盘滴定确定最佳抗原包被浓度和抗体,对酶标二抗稀释倍数、不同封闭液、封闭时间、一抗作用时间、二抗作用时间和显色时间进行优化建立PDCoV间接ELISA检测方法,结果表明抗原包被量为5μg、3%犊牛血清封闭2 h,检测血清稀释100倍,反应45 min,酶标二抗稀释4000倍,反应为1h为最优条件。建立的ELISA方法阴阳性临界值为0.316,与猪流行性腹泻病毒等6种猪常见病原阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,重复性和稳定性均较好。应用建立的间接ELISA方法,对收集自江西各地区282份猪血清进行检测,阳性率为12.8%(36/282),表明PDCoV在我省猪群中普遍存在。本实验建立的PDCoV抗体捕获间接ELISA为临床上猪群PDCoV感染监测和流行病学调查提供了实验依据。