背景:促炎症反应细胞因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）对类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）患者病情的进展以及RA患者的疼痛产生具有至关重要的作用。针对于对抗TNF-α的促炎症反应而新研发并应用于临床的注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（recombinant human type Ⅱ tumor necrosis factor receptor antibody fusion protein,RTNFRII）,已经被证明可有效缓解RA患者的病情和疼痛。虽然临床试验研究和临床应用治疗已经取得了肯定的治疗效果,但RTNFRII是否会通过对抗TNF-α的促炎症反应效应而影响背根神经节（dorsal root ganglion,DRG）神经元不同种类的神经肽的表达并没有相关的研究涉及到。在DRG神经元合成并释放的促炎症反应神经肽和抗炎症反应神经肽,在介导RA伤害性刺激信息传递的过程中发挥重要的作用。基于以上研究背景,本课题将首先利用体外培养的DRG神经元研究不同浓度的TNF-α对神经元促炎症反应神经肽——降钙素基因相关肽（calcitinin gene-related peptide,CGRP）和抗炎症反应神经肽——促生长激素神经肽（galanin,Gal）表达变化的影响作用,以及RTNFRII对TNF-α诱导的CGRP和Gal表达的干扰作用;其次,利用Ⅱ型胶原诱发的RA大鼠动物模型,研究促炎症反应神经肽CGRP和抗炎症反应神经肽Gal的表达变化,以及RTNFRII的缓解疼痛效应与CGRP和Gal表达变化之间的关系;最后,检测RTNFRII对RA患者实验室检测指标的影响,分析RTNFRII缓解RA病情的作用机制。第一部分重组人Ⅱ型TNFR-抗体融合蛋白对培养的DRG神经元神经肽表达的影响目的:TNF-α在神经损伤后会显著上调,TNF-α的上调则会引起神经的破坏。TNF-α可介导多种疾病或损伤状态下的神经病理性疼痛,关于这一点已经被多种动物模型的研究所证实。TNF-α对RA患者病情的进展以及RA患者的疼痛产生具有重要的作用。背根神经节（dorsal root ganglion,DRG）位于椎管内脊神经后根上,是由高度特化的感觉神经元组成的,这些感觉神经元是向整个脊髓传导正常刺激和伤害性刺激的第1级神经元,可传递痛觉、温度觉、触觉、压觉、本体感觉和内脏感觉等。由于DRG神经元种类的复杂性,传导信息的复杂性,神经递质的复杂性,有必要研究与RA疼痛传递有关的神经递质在介导RA疼痛中的作用。降钙素基因相关肽（calcitinin gene-related peptide,CGRP）被认为是在DRG神经元表达的、介导伤害性刺激信息传递的重要神经递质和促炎症反应神经肽。CGRP是一个重要的神经源性炎症分子,感觉神经元内的CGRP表达增加与周围炎性疼痛有关。CGRP由辣椒素敏感感觉神经释放,可导致局部神经源性炎症反应和神经病理性疼痛,其产生和释放的调节还不清楚。辣椒素介导的CGRP释放是经典的感觉神经元CGRP释放机制,但其在内源性释放机制中的意义尚未确定。CGRP受体活化具有中枢和外周致敏作用。因此,抑制伤害性刺激物质CGRP的释放是治疗慢性或病理性疼痛的一个有前景的治疗战略。促生长激素神经肽（galanin,Gal）则主要作为抗炎症反应神经肽而发挥作用。神经损伤和有炎症时,Gal在DRG神经元的表达显著上调,并参与神经病理性疼痛的发生、发展和传递。针对感受伤害性刺激的初级传入神经元,从痛觉信息传递的起始处寻找治疗靶点是开发新的镇痛药的合理策略。有研究显示,对初级传入神经元具有刺激作用的辣椒素作用于体外培养的DRG神经元可使其Gal表达升高,进一步表明Gal与初级感觉神经元感受伤害性刺激的过程密切相关。在促炎症反应细胞因子TNF-α刺激下,Gal在DRG神经元的表达是否会发生改变,并由此来推断是否会介导RA相关的疼痛,是一个有意义的研究方向。方法:本课题建立体外培养的DRG神经元培养模型,利用不同浓度的TNF-α刺激,检测其对DRG神经元不同性质的神经肽CGRP和Gal表达的影响作用,并进一步用RTNFRII孵育具有TNF-α毒性的DRG神经元,检测RTNFRII对TNF-α诱导的CGRP和Gal表达的干扰作用,为进一步研究TNF-α抑制剂通过靶向作用于神经肽而缓解RA疼痛的作用机制。结果:低浓度TNF-α（1 ng/ml）孵育后,神经元的突起长度增加;而中浓度TNF-α（10 ng/ml）和高浓度TNF-α（100 ng/ml）孵育后,神经元的突起长度变短,并且与TNF-α的浓度呈剂量依赖关系,RTNFRII孵育可逆转由TNF-α刺激所引起的神经元突起长度变短;不同浓度的TNF-α孵育后,神经元细胞凋亡率增加,而且神经元细胞凋亡率增加与TNF-α的浓度呈剂量依赖关系,RTNFRII孵育可逆转由TNF-α刺激所引起的神经元凋亡比率增加;不同浓度的TNF-α孵育后,神经元细胞活力减低,而且神经元细胞活力随着TNF-α浓度的增加呈现出逐渐降低的趋势,RTNFRII孵育可逆转由TNF-α刺激所引起的神经元细胞活力降低;低浓度（1 ng/ml）、中浓度（10 ng/ml）TNF-α孵育可使DRG神经元CGRP的表达水平上调,这是DRG神经元应对TNF-α刺激的一个反应性表现,而高浓度（100 ng/ml）TNF-α孵育可使DRG神经元CGRP的表达水平下调,这表明高浓度TNF-α刺激使DRG神经元受到了严重的伤害,而削弱了其表达CGRP的能力,致使CGRP的表达水平下调,RTNFRII可以抵抗TNF-α诱发CGRP表达上调的作用;低浓度（1 ng/ml）、中浓度（10 ng/ml）TNF-α孵育可使DRG神经元Gal的表达水平上调,这是DRG神经元应对TNF-α刺激的一个反应性表现,而高浓度（100 ng/ml）TNF-α孵育可使DRG神经元Gal的表达水平下调,这表明高浓度TNF-α刺激使DRG神经元受到了严重的伤害,而削弱了其表达Gal的能力,致使Gal的表达水平下调,RTNFRII可以抵抗TNF-α诱发Gal mRNA表达上调的作用。结论:本课题的研究结果阐明了 TNF-α介导神经源性炎症与促炎症反应神经肽CGRP和抗炎症反应神经肽Gal的表达变化具有密切的关系,经适当浓度的TNF-α刺激后,不仅促炎症反应神经肽CGRP表达上调,而且抗炎症反应神经肽Gal的表达也会出现上调,这表明了 DRG神经元对促炎症反应细胞因子TNF-α刺激的适应性反应,因为两种不同性质的神经肽都出现了上调的局面,这是在一定的刺激条件下,DRG神经元所作出的适应性反应以保持神经元内稳态的平衡和对抗外来有害刺激的一种有效抉择。第二部分重组人Ⅱ型TNFR-抗体融合蛋白调节神经肽表达缓解大鼠炎症疼痛的实验研究目的:TNF-α是RA发病的一种主要致炎因子,RA疾病状态下,TNF-α的表达上调会触发一系列炎症反应分子的改变,而使疾病状态向严重的方向进展。TNF-α的表达上调不但会介导免疫系统的致炎因子分泌增多和活化,而且还会影响神经系统的反应性变化,初级传入神经元内的TNF-α的表达上调是诱发关节疼痛的一个重要机制之一。在神经病理状态下,与炎症反应相关的神经肽类物质的表达变化,可能是RA疼痛发生的一个新机制。鉴于TNF-α的促炎症反应效应,会相应地引起促炎症反应神经肽和抗炎症反应神经肽的表达变化,在RA疼痛的发生发展过程中发挥一定的作用。RTNFRII是否会通过抑制TNF-α的促炎症反应效应,而进一步影响具有不同生物学效应的神经肽的表达,是一个值得探讨的重要课题。经过近几十年的长期探索和最近的研究,已经确立了 CGRP是DRG神经元的一个重要的神经化学表型,在神经病理状态下,可作为介导伤害性刺激信息传递的重要肽类神经递质。而Gal的作用则更为复杂,根据一系列的研究证据,Gal在周围神经系统对损伤的适应性反应及调节痛觉传递的过程中可能发挥作用,尤其是对伤害性刺激的调节可发挥重要的作用,在神经病理性疼痛中,Gal具备有效对抗伤害性刺激的效应和治疗慢性疼痛的作用,不同浓度的Gal具有不同的调节作用,Gal是一个处理周围痛觉信息的双向调节因子。不同的刺激因素,以及伤害性刺激所处的不同阶段,都对Gal的作用产生影响,使其发挥促进或抑制伤害性刺激的效能。Gal是否参与介导RA的镇痛效应,有待于进一步探讨。方法:建立Ⅱ型胶原诱发的RA大鼠动物模型,探讨促炎症反应神经肽CGRP和抗炎症反应神经肽Gal的表达变化;在此基础上,进一步研究RTNFRII对CGRP和Gal表达的影响作用,分析RTNFRII缓解RA疼痛的新机制。结果:Ⅱ型胶原所诱发的炎症反应可触发大鼠的触觉异常性疼痛和热痛觉过敏,而TNF-α抑制剂RTNFRII可显著增加机械性刺激阈值和热刺激缩足时间阈值,这是RTNFRⅡ缓解神经病理性疼痛的重要标志;Ⅱ型胶原刺激可触发DRG神经元CGRP的表达水平上调,这可能是其诱发触觉异常性疼痛和热痛觉过敏的一个机制,而TNF-α抑制剂RTNFRII则可阻止Ⅱ型胶原诱发的CGRP表达上调,这可能是RTNFRII通过抑制促炎症反应神经肽CGRP的表达而产生镇痛作用的一条途径;Ⅱ型胶原刺激可触发DRG神经元Gal的表达水平上调,这可能是机体应对Ⅱ型胶原诱发炎症的一个反应性改变,而TNF-α抑制剂RTNFRII则可阻止Ⅱ型胶原诱发的Gal表达上调,这可能是RTNFRII通过阻断TNF-α的活性使DRG组织Gal的表达出现了反应性下调。结论:Ⅱ型胶原诱发的RA模型大鼠DRG神经元内促炎症反应神经肽CGRP和抗炎症反应神经肽Gal表达的上升趋势与大鼠的痛觉行为表现是一致的,这可能是DRG神经元对抗神经源性炎症的一种适应性反应;经RTNFRII连续治疗后,DRG神经元CGRP和Gal呈现下降的趋势,这与RTNFRII缓解RA模型鼠痛觉行为的表现是一致的,这可能是RTNFRII缓解RA疼痛的一个新机制,RTNFRII使DRG神经元CGRP和Gal表达下调的确切分子机制尚有待于进一步探讨。通过靶向作用于促炎症反应神经肽CGRP和抗炎症反应神经肽Gal作为缓解RA疼痛的治疗策略将会成为一个新的发展方向。第三部分重组人Ⅱ型TNFR-抗体融合蛋白对RA患者实验室检测指标的影响目的:TNF-α是一个多功能细胞因子,在关键免疫功能介导方面往往是作为一个中心性的生物调节因子而发挥作用,TNF-α在RA疾病进展中的关键作用早就被人们所认识到。因此,针对靶向作用于TNF-α的抑制剂是首次作为生物制剂用于RA治疗的。RTNFRII是最近已经在临床上用作治疗RA一种重要的TNF-α抑制剂,通过对抗TNF-α促炎症反应效应,而发挥有效的缓解RA病情的作用。TNF-α抑制剂所具备的可靠性、有效性、很好的耐受性和起效快等优点,使其成为治疗RA最常用的生物制剂。本课题组在前期的临床试验研究中发现,RTNFRII可有效缓解RA的病情,本研究将进一步探讨RTNFRII对各项实验室检测指标的影响。方法:分析RTNFRⅡ对RA患者红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate,ESR）、C-反应蛋白（C-reactive protein,CRP）、血白细胞（white blood cell,WBC）、中性粒细胞（neutrophile granulocyte,N）、淋巴细胞（lymphocyte,L）、血红细胞（red blood cell,RBC）、血红蛋白（hemoglobin,HGB）、血小板（platelet,PLT）、类风湿因子（rheumatoid factor,RF）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、总胆红素（total bilirubin,TBIL）、血肌酐（serum creatinine,Cr）等多种实验室检测指标的影响作用。结果:RTNFRII可以显著改善ESR和CRP等关键实验室检测指标,这是其发挥治疗作用的重要作用机制;但其他实验室检测指标的变化不大,表明RTNFRII并不会对这些指标产生实质性的影响;而RTNFRII对个别RA患者少数实验室检测指标具有不利的影响,表明RTNFRII具有产生副作用的风险。结论:RTNFRII改善ESR和CRP等关键实验室检测指标是其发挥作用的重要体现,个别RA患者出现了少数实验室检测指标异常变化,表明其产生副作用的风险并不大,而且严重的副作用（如结核、严重感染等）并没有在本课题研究中发现,这可能与本课题所观察的例数不够多有关。进一步大规模地观察研究和长时间对更为复杂的RA患者的应用治疗是必要的,以便获得更为全面的数据,指导临床实际应用。本研究的研究结果不仅为RTNFRII缓解RA病情提供有意义的指导,而且为RTNFRII对RA疗效的实验室检测指标判断方面提供指导性证据。