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钩藤作为传统中药在我国已有千年的使用历史，钩藤中主要的活性成分为吲哚类生物碱，在这些生物碱中钩藤碱含量最高。现代中药药理研究表明，钩藤碱主要作用于心血管系统和中枢神经系统，包括降压、保护脑缺血、抗焦虑及镇静等作用。本实验室前期对其抗焦虑作用进行初步药效学研究，结果表明一定剂量的钩藤碱具有显著的抗焦虑作用。若能研发出一种疗效确切、毒副作用小的抗焦虑中药制剂，将给焦虑症患者带来福音，产生巨大的社会和经济效益。本研究建立了生物样本中钩藤碱的UPLC-MS/MS分析测定方法，通过测定兔经时血药浓度和小鼠体内各主要脏器组织药物浓度，考察了钩藤碱在动物体内的吸收、分布过程，阐明其兔体内药代动力学特征，初步揭示钩藤碱在小鼠体内的分布情况。动物体内药代动力学研究在新药研发和评价过程中起着重要的桥梁作用，所以本实验结果不仅为药效学和毒理学评价提供药物浓度数据，也为设计和优化临床研究给药方案提供相关参考和依据。主要研究内容与方法：一、生物样品中钩藤碱测定方法的研究和建立采用超高效液相色谱（UPLC）为分离手段，三重四级杆串联质谱为检测方式，实验在对分析方法的色谱条件、质谱条件优化的基础上，建立高选择性、高灵敏度的生物基质中低含量钩藤碱测定的分析方法，通过方法的分离特异性、线性、精密度、回收率、稳定性和基质效应等考察，验证所建方法的可行性、准确性、重现性和耐用性。二、兔体内钩藤碱药代动力学研究采用兔体内血药浓度测定法研究钩藤碱动力学，18只雄性新西兰大白兔随机分为三个组，每组6只，对其进行三个剂量（20，40，80mg/kg）的钩藤碱灌胃给药，分别于给药前和给药后15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、12h从兔耳缘静脉采血0.5mL，肝素抗凝后，分离血浆于-80℃冰箱保存。血浆药物浓度用之前确证的UPLC-MS/MS分析方法测定，药代动力学分析采用BECS1.0软件绘制钩藤碱血药浓度-时间曲线图。采用非房室模型方法计算相关药代动力学参数(如半衰期T1/2β,达峰浓度Cmax,达峰时间Tmax,曲线下的面积AUC0-12,清除率CL/F等)。三、钩藤碱小鼠组织分布特征研究将42只雄性昆明小鼠随机分成7组，每组6只，对其进行1个剂量组（40mg/kg）的钩藤碱灌胃给药，在给药前和给药后10min、20min、30min、45min、75min、105min、135min后分批断头处死，时间点的选择包括药物的吸收相、分布相和消除相，提取心、肝、脾、肺、肾、脑组织，用之前确证的UPLC-MS/MS方法进行药物浓度测定，比较药物在各组织中的分布特征，如有无靶向性、是否能通过血脑屏障等。主要研究结果：一、生物样品中钩藤碱测定方法的研究和建立首先优化UPLC-MS/MS测定方法的色谱条件和质谱条件，确定卡马西平为内标；采用乙腈直接沉淀蛋白法对血浆和其他组织样本进行处理；以Acquity UPLC BEH C18（2.1mm×50mm，1.7μm）色谱柱为固定相，以乙腈-0.01mol/L醋酸铵（用冰醋酸调pH值=5）水溶液为流动相，梯度洗脱方式，乙腈比例在0min～5min内从20％变为30%。流速为0.3mL/min，柱温为30℃，进样量3μL。质谱条件:气动辅助电喷雾离子化（ESI）源；正离子检测，多反应监测模式，钩藤碱：[M+H]离子m/z385.3，碎片离子m/z159.8，碰撞能量40V，毛细管电压3.5KV，锥孔电压50V。内标：卡马西平[M+H]离子m/z237.1，碎片离子m/z194.0，碰撞能量40V，毛细管电压3.5KV，锥孔电压50V。脱溶剂温度：350℃；离子源温度：120℃；脱溶剂气流：600L/h。钩藤碱在血浆中0.01～10.25μg/mL的浓度范围内呈线性（r=0.9976），在心组织中0.05～13.75μg/mL的浓度范围内呈线性（r=0.9907），在肝组织中0.025～12.50μg/mL的浓度范围内呈线性（r=0.9947），在脾组织中0.05～13.75μg/mL的浓度范围内呈线性（r=0.9952），在肺组织中0.05～18.00μg/mL的浓度范围内呈线性（r=0.9952），在肾组织中0.05～18.00μg/mL的浓度范围内呈线性（r=0.9974），在脑组织中0.025～12.50μg/mL的浓度范围内呈线性（r=0.9944）。结果证明，本方法有较好的专属性、线性、灵敏度、回收率及稳定性，适合于血浆和组织样本中钩藤碱的分析检测。二、钩藤碱的兔药代动力学特征新西兰大白兔以三个剂量（20、40、80mg/kg）灌胃给药后，采用非房室模型对数据进行处理，确定药代动力学参数。血浆中的消除相T1/2β分别为1.19±0.06h、1.49±0.20h和1.37±0.31h，达峰浓度Cmax分别为1.02±0.29μg/mL、1.92±0.47μg/m和3.50±0.48μg/mL，达峰时间Tmax分别为0.96±0.26h、0.92±0.13h和1.25±0.87h，曲线下的面积AUC0-12分别为2.27±0.27μg h/mL、6.35±2.08μg h/mL和12.41±2.82μg h/mL，清除率CL/F分别为8.93±1.02mL/h/kg、7.10±2.96mL/h/kg和6.75±1.59mL/h/kg，表观分布容积Vd/F分别为15.37±2.34mL/kg、15.80±8.44mL/kg、13.06±2.99mL/kg。在20～80mg/kg的范围内曲线下的面积AUC0-12和达峰浓度Cmax与给药剂量的线性分别为0.9939（P<0.01）和0.9989（P<0.01），表明线性呈正相关。三、钩藤碱小鼠组织分布特征研究昆明小鼠口服给药40mg/kg后，在心、肝、脾、肺、肾、脑组织均有分布，且在20或30min时达到最高值。在给药后不同时间点钩藤碱的组织分布情况有所不同，从整个分布情况来看，钩藤碱在肝脏中含量较其他的高，其次是肾脏和脾脏，浓度较低的为心脏和脑组织。研究结论：1.本实验建立了兔血浆和小鼠主要脏器中钩藤碱浓度的UPLC-MS/MS测定方法。所建方法专属性强，基质效应影响小，且具有较好的线性、灵敏度、精密度和准确度，能满足对钩藤碱药动学和组织分布的研究。2.钩藤碱的血浆药代动力学特征表明，该药吸收和消除较快，且清除率低，表明在血浆中蓄积。线性相关实验表明钩藤碱在20～80mg/kg剂量范围内具有线性动力学的特征。3.口服后钩藤碱在肝脏中的药物浓度最高，提示该药物可能主要在肝脏中代谢，也与钩藤碱归肝经理论相符；其次是肾脏，提示肾脏可能会是药物主要排泄器官；在脑中的浓度相对较少，但是有一定的分布，说明该药能透过血脑屏障。