真菌性角膜炎(fungal keratitis, FK)是最严重的眼部感染性疾病之一,治疗不当迅速恶化,数天内即可导致失明。诱发角膜真菌感染首要的原因在发展中国家为角膜创伤,在发达国家则为角膜接触镜的配戴。湿热的气候是所有地区的高危致病因素。镰刀菌和曲霉菌是真菌性角膜炎最常见的病原体。正常情况下,角膜对真菌感染有很强的抵抗力,当角膜上皮完整性遭到破坏,暴露其下方角膜基质层时,才会发生真菌性角膜炎。角膜基质细胞是角膜天然免疫防御体系的第二道屏障,参与真菌的快速识别、抵抗真菌入侵。Toll样受体(Toll like receptors, TLRs)是天然免疫的关键模式识别受体,通过识别微生物的固有成分病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)发挥重要作用。多种TLRs在角膜基质细胞的胞膜上或胞质内都有表达,其中TLR4的特异性配体为脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),TLR2则能够识别来源于革兰氏阴性和阳性细菌的多种脂肽和脂蛋白成分。我们前期研究发现TLR2及TLR4是角膜启动抗真菌天然免疫的主要受体,在烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus, AF)角膜炎的发生发展过程中发挥决定性作用。TLR2、4的活化能激活下游信号转导通路,从而介导炎性因子的分泌,趋化炎症细胞向角膜基质层迁移,同时诱导抗菌因子产生,杀灭和清除致病原。然而,过度的炎症反应可导致组织损伤和破坏,诱发角膜穿孔或视力丧失,TLRs介导的角膜抗真菌免疫反应必须控制在适度范围内。TLRs通过与接头蛋白分子髓样分化因子88(myeloid differentiation factor88, Myd88)和TIR结构域接头分子(Toll-IL-1receptor domain-containing adaptor inducing interferon-beta, TRIF)结合激活下游信号转导级联反应。TLRs的炎症损伤效应主要与Myd88依赖的经典途径和Myd88依赖的促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)途径有关,二者通过活化核转录因子-κB(nuclear factor κB, NF-κB)和激活蛋白-1(activator protein-1, AP-1),介导多种炎性细胞因子和趋化因子,如白介素(interleukin, IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-a等的分泌。与之相反,MyD88非依赖的TRIF途径能激活转录因子干扰素调节因子(interferon regulatory factor, IRF)-3,从而调节干扰素(interferon, IFN)-β和其他抗炎介质的表达。因此,TLRs的信号转导体系中存在着损伤与保护的微妙平衡,一旦打破将对角膜抗真菌天然免疫反应产生严重的影响。我们的前期研究证明,小剂量的LPS预处理能够诱导永生化人角膜基质细胞(telomerase-immortalized human stroma fibroblasts, THSFs)再编程,调控角膜抗烟曲霉菌天然免疫反应。小剂量LPS预处理THSFs一定时间后再用烟曲霉菌刺激,炎性细胞因子IL-6和IL-8的分泌量减少,抗菌肽CCL20和Tβ4的表达增加,多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte, PMN)的迁移受到抑制。所以,LPS预处理诱导的角膜基质细胞再编程为真菌感染提供了一种保护性机制,在避免过度角膜炎症反应的同时增强角膜先天抗感染能力。但是,关于LPS预处理诱导的烟曲霉菌刺激角膜基质细胞再编程的作用机制目前尚不明确。我们用小剂量LPS预处理12h后,再用大剂量烟曲霉菌刺激THSFs,观察TLR4、TLR2mRNA水平的变化,利用TLR4、2的特异性中和抗体进一步明确TLRs在角膜基质细胞再编程中的作用；继而研究了LPS预处理对TLRs下游Myd88依赖的经典途径、Myd88依赖的MAPK途径以及MyD88非依赖的TRIF信号转导通路的影响。探索脂多糖预处理诱导的基质细胞再编程调控角膜抗真菌天然免疫的分子机制,将为合理调控抗真菌炎症反应、避免角膜组织损伤与破坏以及内环境稳态的重建提供新的靶点和理论依据。第一部分TLR4介导LPS预处理诱导的角膜基质细胞再编程[目的]研究烟曲霉菌刺激下脂多糖预处理引起的角膜基质细胞再编程中的关键受体。[方法]1.AF菌种和菌丝的制备：AF菌株CCTCC93024购自中国典型培养物保藏中心。将菌种接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基,37℃条件下200转每分钟(revolution per minute, rpm)摇床培养24h。收集孢子以108个/ml的终浓度接种于沙氏液体培养基,接种的试管26℃、500rpm摇床培养18h后1000×g离心10min。得到的AF菌丝体漂洗2次后悬浮于Dulbecco’s Hanks平衡盐溶液(Dulbecco’s Hanks balanced salt solution, D-Hanks)中,56℃加热60min灭活。然后Potter-Elvehjem组织匀浆器将菌丝研磨成20～40μm长的片段,浓度调整为1×106个菌丝体片段/ml,制成AF抗原刺激液。2.细胞的培养：THSFs由Fu-Shin X.Yu教授和Ilene K. Gipson教授慷慨提供。细胞在37℃、5%CO2的湿润条件下用含10%新生牛血清的改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM)培养。细胞以4×105个/孔的浓度接种于6孔微培养板并生长至80%融合(2天左右),不含血清的DMEM培养液饥饿16h后用于刺激试验。3.细胞的刺激和耐受的诱导：THSF细胞经LPS (10ng/ml)预处理12h后用不含血清的培养基冲洗2次,给予AF菌丝(106个/ml)再次刺激。第2次刺激后不同时间点(30min,1h,3h,6h)收取细胞,荧光定量实时聚合酶链反应(real time-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测TLR4mRNA的水平,或于第2次刺激后4h收取细胞及细胞上清,RT-PCR检测TLR2的基因表达,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测IL-6、 IL-8和TNF-α的分泌。4.抗体中和能力的测定和受体封闭实验：利用TLR2和TLR4的单克隆抗体孵育THSFs进行受体封闭试验。THSF细胞与抗人TLR4(100ug/ml)、抗人TLR2(100ug/ml)或抗人TLR4(100ug/ml)+TLR2(100ug/ml)单克隆抗体共孵育30min后,37℃条件下酵母聚糖(1mg/ml)或LPS (1μg/ml)刺激12h,或LPS (10ng/ml)预处理12h后AF菌丝(106个/ml)再次刺激4h。收取细胞培养上清和细胞裂解液,ELISA检测IL-6、IL-8、TNF-α的分泌或RT-PCR检测TLR2的表达。[结果]1.单克隆抗体可有效封闭TLR2及TLR4:TLR2、4抗体对THSF中IL-8和TNF-α的基础分泌没有影响,TLR2配体酵母聚糖或TLR4配体脂多糖均刺激THSF细胞高表达IL-8和TNF-α,中和性抗体封闭相应TLR后这种刺激作用消失,抗体封闭组与空白对照组的炎性因子分泌量无明显统计学差异。因此,我们使用的特异性单克隆抗体能够有效的阻断相应TLRs的功能。2.LPS预处理对大剂量AF诱导的TLR4表达的影响：为了研究THSF细胞中LPS预处理对TLR4水平的调节作用,10ng/ml的LPS预处理12h后,烟曲霉菌菌丝再次刺激THSF, RT-PCR检测TLR4的表达。结果显示第二次刺激1小时、3小时后LPS预处理组TLR4mRNA的表达量均低于单纯AF刺激组。3.LPS预处理对烟曲霉菌刺激角膜基质细胞炎性因子分泌的抑制作用依赖于TLR4的功能：在前期研究中我们发现,10ng/ml LPS预处理能减少再次烟曲霉菌刺激诱导的角膜基质细胞IL-6和IL-8的分泌。在此我们进一步探讨这种炎性细胞因子表达的抑制现象是否依赖于TLR4的作用。在LPS预处理之前封闭TLR4,培养上清中IL-6、IL-8和TNF-α的含量较未封闭TLR4的LPS预处理组增加,与未封闭TLR4的无预处理烟曲霉菌刺激组之间没有明显差异。4.TLR2在LPS预处理诱导的角膜基质细胞再编程中的作用研究：实时荧光定量PCR检测TLR2的表达,结果显示LPS预处理对烟曲霉菌诱导的角膜基质细胞中TLR2mRNA的水平没有明显影响。虽然TLR4单克隆抗体对TLR2的基础表达没有刺激作用,但预处理前封闭TLR4, THSF细胞中烟曲霉菌刺激的TLR2表达明显上调。LPS预处理前利用特异性抗体将TLR2与TLR4共同封闭,IL-6、IL-8和TNF-α的分泌较无预处理对照组明显下降,接近基础分泌水平。[结论]1.在角膜基质细胞再编程中,TLR4作为关键的受体,能特异性的介导LPS预处理引起的炎性细胞因子抑制。2.LPS预处理对烟曲霉菌诱导的TLR2表达没有明显影响,但是封闭TLR4后TLR2是维持炎性细胞因子分泌水平的关键因素。第二部分LPS预处理诱导的角膜基质细胞再编程对TLR4下游信号转导通路的调控[目的]研究THSF细胞中LPS预处理对TLR4下游Myd88依赖的经典途径、Myd88依赖的MAPK途径以及MyD88非依赖的TRIF途径的影响。[方法]用小剂量LPS预处理12h后,再用大剂量AF刺激THSF,培养0.5、1、3、6、12小时分别收取细胞及培养上清,RT-PCR、ELISA及wenstern blot检测Myd88依赖的经典途径的关键因子MyD88、IκB-α、NF-Kb-p65, Myd88依赖的MAPK途径的关键因子MAPK3、AP-1、ERK1/2以及Myd88非依赖的TRIF途径的关键因子TRIF、IRF-3、IFN-β的基因和蛋白水平；细胞免疫荧光检测转录因子NF-Kb-p65向细胞核内的转移。[结果]1.Myd88依赖的经典途径的抑制：RT-PCR结果显示烟曲霉菌再次刺激1小时、3小时后LPS预处理组MyD88mRNA的表达低于非预处理组；IκB-α mRNA及蛋白的表达高于非预处理组,间接说明1小时、3小时LPS预处理组NF-κB的表达低于非预处理组；NF-κB-p65的蛋白表达低于非预处理组,向胞核内的转移也受到抑制。2.Myd88依赖的MAPK途径下游信号因子的表达下调：1小时、3小时LPS预处理组MAPK3、AP-1mRNA的表达均低于非预处理组,western blot结果显示1小时、3小时ERK1/2的蛋白表达量预处理组也明显低于无预处理组。3.Myd88非依赖的TRIF途径下游信号因子表达和细胞因子分泌上调：LPS预处理后再用烟曲霉菌菌丝刺激THSF细胞,RT-PCR结果显示真菌刺激3小时、6小时后TRIF、IRF3、IFN-β mRNA的表达增加,而LPS预处理组TRIF途径关键信号因子的水平较无预处理组进一步升高。IFN-β的ELISA检测显示了一致的结果。[结论]1.在角膜基质细胞再编程中,介导炎性细胞因子产生的Myd88依赖的经典途径以及Myd88依赖的MAPK途径作用受到抑制。2.LPS预处理促进MyD88非依赖的TRIF途径的功能,进一步增强其免疫保护作用。