研究背景:放射治疗是当今恶性肿瘤的三大治疗手段之一,在头颈部肿瘤的治疗中放疗占据着重要地位。虽然头颈部肿瘤的总体生存率已获得明显改善,然而治疗后复发及远处转移仍然是目前头颈部肿瘤病人死亡的主要原因。当前恶性肿瘤放射治疗所面临的最大障碍主要包括肿瘤细胞自身的辐射抵抗以及周围正常组织损伤对剂量的限制。目前的研究发现肿瘤细胞所处的局部微环境对于肿瘤的治疗反应具有重要影响。研究显示大多数实体瘤能产生乏氧区域,其中头颈部肿瘤的乏氧最为常见。局部乏氧作为一个重要的肿瘤微环境特征,赋予了肿瘤细胞特殊的生物学功能,被认为是导致肿瘤放疗抵抗最为关键的因素,也是当前肿瘤生物学领域研究的热点和重点。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)是一种重要的循环内分泌系统,参与调节机体血压、维持血流和电解质稳定。近来有研究发现,机体多处组织存在局部RAS,这些组织细胞自身能表达肾素、血管紧张素原、ACE或者各种蛋白酶,通过ACE依赖或者非ACE依赖的途径产生AngⅡ,以自分泌或旁分泌的方式发挥生物学效应,对组织的生理功能及其结构起重要调节作用。值得我们注意的是,已有研究在一些肿瘤组织或者小鼠移植瘤模型中检测到AngⅡ的存在。AngⅡ能诱导血管内皮生成因子(VEGF)、GLUT1及HIF-1的表达,参与多种慢性疾病的发生发展。在肿瘤组织中,这些因子通常与肿瘤乏氧微环境密切相关,参与肿瘤细胞在乏氧微环境中的重要生物学功能。在大多数实体肿瘤中,根据与血管距离的大小形成不同的肿瘤微环境区域,依次为常氧区-乏氧区(单纯乏氧+乏氧低糖)-坏死区。因此,我们推测Ang Ⅱ可能在肿瘤内的乏氧微环境中扮演者重要作用。本研究揭示局部RAS存在于头颈部肿瘤乏氧区域的特性;其次,阐明乏氧肿瘤局部RAS对HIF-1α分子的调节功能及对辐射抵抗的影响。不仅为深入理解头颈部肿瘤乏氧介导的辐射抵抗机制提供新的理论基础,而且为克服头颈部肿瘤放疗抵抗并从根本上减少放疗后残留及复发提供了新的策略和手段。由于放射治疗射线的特点,放射治疗在对人体内肿瘤细胞造成杀伤的同时,不可避免的对周围正常组织及器官造成一定的损伤,而正常组织放射损伤的存在,是限制放射治疗发挥其最大杀伤肿瘤作用的重要因素。随着放射治疗技术的发展,逐渐出现了一系列新型的精确放射治疗手段,其中包括三维适形调强放疗,图像引导调强放疗等等。这些先进放疗技术的出现,使得放射治疗进入了一个崭新的发展阶段。相比于传统放疗,高精度放疗可以更好的将射线剂量传递到目标靶区,尽量减少周围正常组织的受量,从而减少周围正常组织的放射损伤,提高肿瘤的局部控制率。由于输出射线时更复杂的处理过程,高精度放疗比传统放疗需要更多的剂量输出时间。大多数精确放疗需要十五分钟以上的剂量输出时间,有些放疗技术配合呼吸门控调节射线输出则需要接近一个小时的剂量输出时间,而传统放疗仅需要1至3分钟的时间来输出目的剂量。最近,已有研究发现放疗过程中延长照射剂量输出时间使得射线对肿瘤的杀伤作用减弱,这一现象的原因可能是肿瘤细胞在延长的剂量输出时间过程中发生了亚致死损伤性修复。然而,延长照射剂量输出时间对正常组织辐射损伤的影响及其机制尚不明确。正常组织可以分为早反应组织和晚反应组织,而早晚反应组织各有其特点,它们拥有不同的α/α比值,早反应组织的细胞更新比晚反应组织快,在接受辐射以后早反应组织的损伤会很快的表现出来,其主要通过活跃增殖来使自身得以修复;而晚反应组织的损伤出现很晚,之前的研究发现晚反应组织比早反应组织具有更强的亚致死损伤修复能力。因此,我们推测晚反应组织和早反应组织对延长照射剂量输出时间可能有不同的反应。感音神经性听力损失(SNHL)是头颈部肿瘤病人接受放射治疗后所发生的一种常见的晚期并发症,其主要原因是由于耳蜗毛细胞的辐射损伤。辐射引起的严重皮肤反应和口腔黏膜炎是放射治疗头颈部肿瘤过程中常见的早期并发症,其原因主要是由于过度的炎症和上皮消融,包括放射治疗造成的角质细胞损伤。在这项研究中,我们使用了小鼠耳蜗毛细胞HEI-OC1和人永生化表皮角质细胞HaCaT作为模型来研究不同类型的正常组织细胞对延长照射剂量输出时间的反应。自噬,即细胞的一种"自我吞噬"现象,是细胞自身代谢降解的一种过程,在此过程中,细胞将自身细胞质的部分成分运送至溶酶体中降解,其中的大分子以及细胞器进行再循环利用,使细胞的完整性得以保持。它在细胞处于不利的环境条件下得以激活,是维持细胞内稳态和细胞的健康的重要因素。近年来,自噬在人类疾病中的作用及其确切的分子机制得到越来越多的研究关注。最近的研究发现,自噬在间充质干细胞放射损伤的自身修复过程中也发挥着重要作用。然而,早晚反应组织辐射损伤中自噬的具体作用和机制仍不清楚。本研究发现延长照射剂量输出时间可以减少正常组织的辐射损伤,晚反应组织细胞HEI-OC1比早反应组织细胞HaCaT对延长照射剂量输出时间更加敏感,而这一现象的原因可能是延长照射剂量输出时间激活了晚反应组织细胞的ATM-AMPK信号通路,从而诱导发生了明显的自噬,进而抑制辐射诱导的ROS的累积,减少了辐射损伤。而在早反应组织细胞中并没有发生类似的反应。本研究阐明了早晚反应组织在精确放疗过程中所发生的特异性改变,并揭示了其生物学机制,为更好的保护正常组织辐射损伤提供了新的理论基础。第一章局部RAS介导头颈部肿瘤乏氧微环境辐射抵抗的功能及机制目的:揭示局部RAS存在于肿瘤乏氧区域的特性以及局部RAS介导肿瘤乏氧区域辐射抵抗的功能及机制。方法:1.检测头颈部肿瘤中血管紧张素Ⅱ在乏氧区域的表达利用Elisa实验以及细胞免疫荧光实验检测鼻咽癌细胞在体外不同氧环境(包括常氧常糖、乏氧常糖及乏氧低糖)下的血管紧张素Ⅱ表达情况。于裸鼠大腿皮下构建鼻咽癌CNE2细胞的动物移植瘤模型,结合乏氧诱导因子HIF-1α抗体,通过免疫荧光技术分析血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)在肿瘤中的分布与与HIF-1α表达的区域的相关性,进一步验证AngⅡ与肿瘤乏氧区域的关系。2.检测血管紧张素Ⅱ与头颈部肿瘤细胞辐射敏感性的关系通过克隆形成实验检测Ang Ⅱ和乏氧对体外培养肿瘤细胞辐射敏感性的影响,并观察添加坎地沙坦对Ang Ⅱ及乏氧介导的辐射抵抗的作用。将预先设计的细胞数接种于6孔板,分为0,2,4,6,8Gy五个剂量组,每组设置三个复孔。照射后于孵箱继续培养10-14天,当可用肉眼观察到培养板中的克隆时,终止培养,并用结晶紫染色,染色后在显微镜下观察并计数含有50个细胞数以上的克隆数目。计算克隆形成率以及存活分数,并运用GraphPad Prism 5.0软件拟合多靶单击模型曲线。通过皮下注射鼻咽癌CNE2细胞建立小鼠异体移植瘤模型,观察坎地沙坦对动物体内肿瘤辐射敏感性的影响。3.检测血管紧张素Ⅱ调控头颈部肿瘤细胞辐射敏感性的信号通路采用Western blot实验来检测血管紧张素Ⅱ调控头颈部肿瘤细胞辐射敏感性的信号通路。用RIPA裂解液裂解细胞提取总蛋白,根据BCA法测定蛋白浓度,添加5×SDS-PAGE loading Buffer使蛋白变性,电泳后进行转膜和封闭,孵育相应的一抗以及二抗,最后使用ECL法进行蛋白显影。4.统计分析采用SPSS13.0软件进行统计分析,两组样本均数比较采用两样本t检验,两组以上样本均数采用完全随机设计资料的方差分析(One-WayANOVA)进行比较,采用Levene’s Test进行方差齐性检验。肿瘤体积比较采用重复测量的方差分析。P值<0.05认为有统计学意义。结果:1.局部RAS存在于肿瘤乏氧区域通过ELISA检测试剂盒检测CNE1和CNE2细胞在不同氧浓度下的血管紧张素Ⅱ生成情况。结果显示在体外普通培养(常氧常糖)条件下CNE1和CNE2细胞培养基中能检测到少量Ang Ⅱ的水平,而在乏氧常糖(CNE1细胞P=0.001,CNE2 细胞 P=0.003)或者乏氧低糖(CNE1 细胞 P<0.001,CNE2 细胞 P=0.001)的条件下两株细胞培养基中可检测到Ang Ⅱ的水平显著升高。利用细胞免疫荧光检测发现在常氧常糖条件下培养的CNE2细胞中仅有少量Ang Ⅱ表达在胞浆中,而在乏氧培养的细胞胞浆中Ang Ⅱ的水平显著升高。进一步,我们在小鼠移植瘤模型中的荧光检测发现Ang Ⅱ主要集中于乏氧诱导因子HIF-1α高表达的区域。这一系列结果提示由肿瘤细胞自身产生的局部RAS存在于头颈部肿瘤乏氧微环境中。2.局部RAS机制调节乏氧肿瘤细胞的辐射抵抗克隆形成实验显示乏氧及乏氧低糖条件下鼻咽癌CNE2细胞的辐射抵抗能力具有显著差异(2Gy 组 P=0.003,4Gy 组 P=0.004,6Gy 组 P=0.004,8Gy 组P=0.004),并且乏氧常糖以及乏氧低糖可以增加细胞的辐射抵抗。而AT1R拮抗剂坎地沙坦能逆转乏氧及乏氧低糖条件下CNE2细胞辐射抵抗能力,显著增加其辐射敏感性(乏氧常糖2Gy组P=0.034,4Gy组P=0.023,6Gy组P=0.014,8Gy 组 P=0.032;乏氧低糖 2Gy 组 P=0.042,4Gy 组 P=0.020,6Gy 组 P=0.018,8Gy组P=0.010)。而在常规培养条件下,坎地沙坦并没有显著提高CNE2细胞的辐射敏感性,而Ang Ⅱ显著降低了 CNE2细胞在常氧常糖培养环境下的辐射敏感性(2Gy 组 P=0.043,4Gy 组 P=0.044,6Gy 组 P=0.008,8Gy 组 P=0.039)。裸鼠皮下成瘤实验发现AT1R特异性拮抗剂坎地沙坦处理组较对照组显著减小了放疗后肿瘤的体积(P=0.013)。这些结果提示,肿瘤局部产生的RAS可能参与了乏氧肿瘤细胞对辐射的抵抗3.Ang Ⅱ在乏氧微环境中调节HIF-1α蛋白的活性Western blot实验显示Ang Ⅱ处理及乏氧条件下的CNE2细胞的HIF-1α蛋白显著升高,并且加入剂坎地沙坦后可以抑制HIF-1α蛋白的升高。进一步检测调控HIF-1α表达的信号通路,发现调控其mRNA的翻译的MAPK和PI3K/Akt信号通路在Ang Ⅱ处理及乏氧条件下明显激活,加入AT1R特异性拮抗剂坎地沙坦可以抑制这两条信号通路的激活。以上结果提示,乏氧条件下升高的Ang Ⅱ可能激活了 MAPK和PI3K/Akt信号通路从而提高了 HIF-1α mRNA的翻译效率。结论:本研究揭示局部RAS存在于头颈部肿瘤乏氧区域的特性;其次,证明乏氧肿瘤局部RAS介导了肿瘤的辐射抵抗,使用AT1R特异性拮抗剂坎地沙坦可以特异的在乏氧环境下增加CNE2细胞的辐射敏感性;最后,我们发现Ang Ⅱ可能通过激活MAPK和PI3K/Akt信号通路来调节HIF-1α分子,从而介导了细胞的辐射抵抗。第二章延长照射剂量输出时间对正常组织辐射损伤的影响及机制目的:阐明早晚反应正常组织对精确放疗所造成的照射剂量输出时间延长的反应及机制。方法:1.细胞辐射模型研究延长照射剂量输出时间对正常组织细胞杀伤的影响:采用2Gy/d照射(剂量率200cGy/min),分别经过0-5d的照射,形成0,2,4,6,8,10Gy六个剂量组,其中模拟常规放疗组连续的输出2Gy,其剂量输出时间为1min,而模拟高精度放疗组将2Gy分成8次间隔一定时间(2,5,7min)输出,其剂量输出时间分别为15,36,50min。研究延长照射剂量输出时间对正常组织细胞凋亡、DNA损伤以及自噬的影响:采用10Gy单次照射(剂量率500cGy/min),模拟常规放疗组的剂量输出时间为2min,模拟高精度放疗组的剂量输出时间为16,37,51min。2.克隆形成实验细胞经消化后制成单细胞悬液,按照预先设计数量接种于6孔板或者96孔板中,设0,2,4,6,8,10Gy六个剂量组,每个剂量组设置三个复孔。种板待细胞贴壁后进行照射,照射后将细胞置于37℃、饱和湿度培养箱内继续培养10-14天。当培养板孔中出现肉眼可见的克隆时,终止培养,用甲醇固定后予以1%结晶紫进行染色,用显微镜观察并计数含有50个细胞数以上的克隆数目,计算克隆形成率和存活分数,并运用GraphPad Prism 5.0软件进行LQ模型曲线拟合。3.细胞凋亡检测将5×105/孔的细胞接种于6孔板中,接受照射后24小时检测细胞凋亡,采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒对细胞进行荧光染色,最后用流式细胞仪检测细胞荧光标记。4.DNA损伤检测细胞爬片并进行照射。固定细胞后将其与r-h2ax 一抗进行孵育结合,荧光二抗孵育后在共聚焦荧光显微镜下计数细胞核内r-h2ax荧光点。5.Western blot 实验处理后细胞提取总蛋白,按照BCA法测定蛋白浓度,添加5×SDS-PAGE loading Buffer进行蛋白变性,然后进行电泳、转膜、封闭,并分别孵育一抗和二抗,最后在显影仪上采用ECL法在进行显影。6.构建稳定表达GFP-LC3的HEI-OC1和HaCaT细胞株在6孔板中接种5×105/孔的细胞,待细胞密度达40%左右时,将MAP1LC3B和对照LV5-NC慢病毒悬液100μl/孔(MOI=20)加入培养液中,并在其中2孔中加入终浓度为6ug/ml的polybrene以增加感染效率,继续培养24h后更换培养基,再培养72h后使用荧光显微镜拍照并计算病毒感染效率。最后使用流式细胞仪来分选GFP阳性的细胞,从而获得GFP阳性细胞比例较高的细胞来进行扩大培养,以获得稳定表达GFP-LC3的细胞。7.细胞ROS检测细胞以1× 103/每孔接种于96孔板中。接受照射后培养24小时,除去培养基后,37℃下将细胞与DCFH-DA孵育结合20分钟。PBS洗涤后,使用荧光酶标仪,以488nm的激发波长和525nm的发射波长进行荧光检测。8.统计分析采用SPSS13.0软件进行统计分析,两组样本均数比较采用两样本t检验,两组以上样本均数采用完全随机设计资料的方差分析(One-Way ANOVA)进行比较,方差齐性检验采用Levene’s Test。P值<0.05认为有统计学意义。结果:1.延长剂量输出时间减少了正常组织的损伤,并且早晚反应组织对延长剂量输出时间显示出不同的敏感性克隆形成实验显示,延长剂量输出时间提高了早反应组织细胞HaCaT和晚反应组织细胞HEI-OC1照射后的生存分数,而且拥有较低α/β值的晚反应组织细胞HEI-OC1(α/β≈1.096)比早反应组织细胞HaCaT(α/β≈9.83)从延长剂量输出时间中的获益更大。凋亡实验显示,延长剂量输出时间减少了两种细胞照射后的凋亡,HEI-OC1较HaCaT减少的更显著。通过运用r-h2ax荧光点计数作为评估细胞DNA损伤的指标,结果显示延长剂量输出时间减少了两种细胞照射后的DNA损伤,而且晚反应组织细胞HEI-OC1比早反应组织细胞HaCaT减少的更显著。以上结果显示,延长剂量输出时间可以减少正常组织的辐射损伤,并且晚反应组织对延长剂量输出时间显示出更强的敏感性。2.延长剂量输出时间在HEI-OC1细胞中通过激活ATM-AMPK信号通路进而激活自噬在接受延长剂量输出时间的照射后,晚反应组织HEI-OC1细胞内的自噬相关蛋白表达随着输出时间的延长逐渐增加,提示细胞自噬的逐渐增强,而这一现象并没有出现在早反应组织细胞HaCaT。GFP-LC3荧光聚集点计数结果同样显示在接受延长剂量输出时间的照射后,HEI-OC1细胞内GFP-LC3荧光聚集点增加,提示自噬的激活。通过进一步检测自噬相关信号通路,我们发现在接受延长剂量输出时间的照射后,ATM-AMPK信号通路在HEI-OC1细胞内发生了激活。在运用ATM通路抑制剂后,延长剂量输出时间所导致的细胞自噬增强几乎消失。以上结果说明延长剂量输出时间可以通过激活ATM-AMPK信号通路进而在晚反应组织细胞HEI-OC1中激活自噬。3.延长剂量输出时间通过激活自噬减少细胞内的ROS,进而减少晚反应组织细胞辐射损伤HEI-OC1细胞在辐射前加入自噬抑制剂3-MA或者ATM通路抑制剂KU55933以直接抑制自噬或者抑制ATM通路的激活,来验证自噬对延长剂量输出时间保护晚反应组织作用的影响。克隆形成实验显示在加入3-MA或者KU55933之后,延长剂量输出时间对HEI-OC1细胞的保护作用显著减弱(对照组P=0.005,3-MA组P=0.148,KU55933组P=0.052)。通过对细胞内ROS的检测,我们还发现在加入3-MA或者KU55933后,延长剂量输出时间对HEI-OC1细胞内的ROS的抑制作用显著减弱(对照组P=0.007,3-MA组P=0.987,KU55933组P=0.991)。以上结果提示延长剂量输出时间所激活的自噬可以减少晚反应组织细胞内的ROS,进而减少细胞辐射损伤。结论:模拟高精度放疗的延长照射剂量输出时间可以减少早晚反应正常组织的辐射损伤,晚反应组织细胞HEI-OC1比早反应组织细胞HaCaT对延长照射剂量输出时间更敏感,这一现象的原因可能是延长照射剂量输出时间激活了晚反应组织细胞内的ATM-AMPK信号通路,进而激活明显的自噬,从而抑制辐射诱导的ROS的累积,减少了细胞的辐射损伤。而在早反应组织细胞中并没有发生类似的反应。