论文部分内容阅读
抗凝药物肝素(heparin,HP)及其结构类似物硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)都是高度硫酸化糖胺聚糖家族的成员,大量分布于哺乳动物细胞表面和细胞外基质。HS/HP通过糖链中大量不同的精细寡糖片段与肝素结合蛋白(heparin binding proteins,HBPs)相互作用,在凝血、胚胎发育、细胞分化和肿瘤发生发展等过程中起着重要的调节作用。目前发现的HBPs已经超过300种,其中与血管生成(angiogenesis)有关的包括成纤维细胞生长因子(FGFs)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、内皮抑素(ES)等。探究肝素与血管生成各因子相互作用的结构基础,有助于阐明肝素的抗肿瘤转移机制。然而,高度不均一的微观结构对深入阐明天然肝素在血管生成中的作用始终是一个巨大挑战。最近,肝素寡糖的合成取得了长足进展,涌现出了许多新的合成方法和策略,为制备结构多样的肝素寡糖奠定了坚实的基础。本课题利用前期建立的化学酶法合成策略,设计、合成了一系列结构复杂的长链肝素寡糖;然后利用亲和层析技术探究了肝素寡糖与碱性FGF(bFGF)的肝素结合域之间的亲和相互作用,以期揭示肝素与bFGF相互作用的结构基础,为发现靶向血管生成的抗肿瘤肝素寡糖类创新药物奠定基础。本学位论文取得的成果和结论包括以下几个方面:1.糖基供体和硫酸基供体的规模化制备及结构表征尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸(uridine 5’-diphosphate glucuronic acid,UDP-G1cA)是以尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-G1c)为原料,在UDP-G1c脱氢酶(UDP-G1c DH)和L-乳酸脱氢酶(LDH)双酶催化作用下合成的;尿苷二磷酸-N-三氟乙酰氨基葡萄糖(uridine 5’-diphosphate-N-trifluoroacetylglucosamine,UDP-G1cNTFA)和尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(uridine 5’-diphosphate-N-acetylglucosamine,UDP-GlcNAc)是以N-三氟乙酰氨基葡萄糖(G1cNTFA)或N-乙酰氨基葡萄糖(G1cNAc)为原料,在N-乙酰氨基葡萄糖1-激酶(NahK)、N-乙酰氨基葡萄糖尿苷转移酶(G1mU)和无机焦磷酸化酶(PPA)的共同催化下经过一步反应合成的。以三磷酸腺苷(ATP)及硫酸钠为原料,在ATP硫酸化酶-APS激酶(KAST-APSK)及PPA共同催化下,利用一锅多酶法合成腺苷3’-磷-5’-磷酰硫酸(3’-phosphoadenosine-5’-phosphosulfate,PAPS)。以上四种供体均采用Q-Sepharose强阴离子交换柱层析分离纯化,合成的规模均达克级,HPLC鉴定纯度均>95%。2.肝素六糖的合成、纯化及结构表征肝素六糖的合成中,我们利用带有UV标签的4-对硝基苯基葡萄糖醛酸(G1cA-PNP)为起始原料,在糖基转移酶KfiA和PmHS2的交替催化下,以UDP-G1cNTFA(或UDP-G1cNAc)和UDP-G1cA为糖基供体,使骨架糖链自非还原端延长,经反相C18柱分离纯化得到纯度为95%以上的六糖骨架;骨架寡糖脱除三氟乙酰基后,经N-硫酸基转移酶(NST)的催化作用,PAPS作为硫酸基供体,以81%的产率得到了 N-硫酸化的肝素六糖(6mer-1);接下来在C5-异构化酶(C5-epi)和2-O-硫酸基转移酶(20ST)的双酶催化作用下,使G1cA残基直接转换为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S),以66%的产率得到了含IdoA2S的肝素六糖(6mer-2);最后由6-0-硫酸基转移酶(60ST)催化使葡萄糖胺的6-OH发生硫酸化,以65%的产率得到了 6-O-硫酸化肝素六糖(6mer-3)。6mer-1、6mer-2、6mer-3 均经 Q-Sepharose 强阴离子交换柱分离纯化得到,纯度均在99%以上,制备规模均达百毫克级,ESI-MS和NMR分析其结构正确。3.肝素八糖的合成、纯化及结构表征肝素八糖的合成中,以G1cA-PNP为起始原料,利用糖基转移酶KfiA和PmHS2的交替催化作用合成、C18柱分离纯化得到纯度达95%的八糖骨架;脱除三氟乙酰基并在NST的催化下以66%的产率得到了 N-硫酸化肝素八糖(8mer-1);尝试对含有两个可异构化/2-O-硫酸化的G1cA位点的肝素八糖同时进行修饰反应,首次成功地以44%的总产率得到了含两个IdoA2S的肝素八糖(8mer-2);最后在60ST作用下合成了 6-0-硫酸化肝素八糖(8mer-3),反应总产率40%。此外,对N-硫酸化的肝素八糖8mer-1直接进行6-O-硫酸化修饰,得到仅含G1cA不含IdoA2S的6-O-硫酸化的肝素八糖(8mer-4),反应产率达64%。反应均以强阴离子交换柱分离纯化,四种肝素八糖纯度均在95%以上,ESI-MS和NMR分析其结构正确。4.肝素十糖的合成、纯化及结构表征在肝素十糖的合成中,同样以G1cA-PNP为起始原料,利用糖基转移酶KfiA和PmHS2的交替作用合成、C18柱分离纯化得九糖骨架;依次进行NST和KfiA催化的反应,以60%的终产率得到了 N-硫酸化的肝素十糖(1Omer-1);最后进行60ST催化反应,以52%的的产率得到6-0-硫酸化的肝素十糖(1Omer-2)。反应均经强阴离子交换柱分离纯化,HPLC鉴定两种十糖的纯度均在95%以上,ESI-MS和NMR分析其结构正确。5.肝素寡糖与FGF2相互作用的初步研究利用亲和层析技术,分析上述长链寡糖与FGF2的肝素结合域之间的结合力大小的差异,初步揭示了肝素寡糖与FGF2作用的可能结构特点:寡糖链的长度以及寡糖的2-O-硫酸化和6-0-硫酸化可能同时影响着其与FGF2的亲和力大小。