第一部分Her2在结直肠癌细胞株的胞膜及胞浆表达并可促进癌细胞的增生1.研究背景和目的在世界范围内,结直肠癌在女性癌症患者中的发病率占第二位,在男性癌症患者中的发病率占第三位。对结直肠癌的发生和进展与信号通路及其具体机制的研究一直是医学界的热点,探讨和发现新的治疗靶点和治疗方法对改善结直肠癌患者的生活质量,提高患者的生存时间都有着重要的价值和意义。人类表皮生长因子受体2(Her2)是重要的乳腺癌预后判断因子,Her2阳性(扩增或过表达)与乳腺癌的预后显著相关。有关Her2与大肠癌的关系的研究做了很多,但目前仍尚未达成一致的结论,临床方面也缺乏明确的针对Her2基因在结直肠癌治疗和预后判断方面的明确的指南。进一步的深入研究Her2基因在结直肠癌的表达,并了解其对结直肠癌治疗的潜在应用价值有着重要的临床意义。本研究通过检测5种人结直肠癌细胞株中Her2 mRNA的表达,建立稳定表达Her2基因的人结直肠癌细胞株,siRNA敲减Her2基因表达的人结直肠癌细胞株,通过CCK8检测法、细胞划痕实验和Transwell侵袭实验等研究方法,观察Her2对结直肠癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力的影响。2.材料和方法2.1细胞人结直肠癌细胞株DLD-1、HCT8、HT29、HCT116、SW480购自中国科学院上海细胞库,人乳腺癌细胞株SK-BR-3购自ACTT细胞库。2.2 Real-time RT-PCR检测采用SYBR(?)Premix Ex Taq real time PCR Kit(TAKARA)检测五种人结直肠癌细胞株DLD-1、HCT8、HT29、HCT116、SW480及一种人乳腺癌细胞株SK-BR-3中的Her2表达。2.3建立稳定的过表达Her2基因的人结直肠癌细胞株(SW480)以及siRNA沉默Her2表达的结直肠癌细胞株(HT-29)通过将Her2基因的胞外区的近膜部分序列插入真核表达载体PIRES2-EGFP中,构建质粒PIRES2-EGFP-HER2,从而建立稳定表达Her2基因的人结直肠癌细胞株(SW480)。用重组慢病毒Her2-RNAi-LV转染人结直肠癌细胞株HT-29,建立siRNA沉默Her2基因表达的细胞株。2.4免疫组化法检测Her2蛋白的表达部位分别用两种不同的Her2单克隆抗体,采用免疫组化方式检测膜内部分的Her2表达(Ab-3)及膜外部分的Her2表达(CB11)。细胞免疫组化胞膜染色的结果判读使用胃癌Her2的染色判读和评分标准,即1+结果是指>10%肿瘤细胞微弱或隐约可见细胞膜染色。2+结果是指>10%肿瘤细胞有弱至中度的基底侧膜、侧膜或完全性胞膜染色。3+结果是指>10%肿瘤细胞基底侧膜、侧膜或完全性胞膜强染色。2.5 CCK8法、细胞划痕实验和Transwell侵袭实验通过上述方法研究Her2对人结直肠癌细胞株体外增殖、迁移和侵袭能力的影响。2.6统计学处理利用统计软件IBM SPSS19.0对相关数据进行统计分析。两组间差异分析采用Student’s t检验,多组间差异分析采用Oneway ANOVA检验,率的组间比较采用卡方检验。P<0.05为有显著差异。3.研究结果3.1结直肠癌细胞株中Her2的表达5种人结直肠癌细胞株中,HT29细胞株存在Her2基因mRNA水平高表达。其它细胞株少量表达或不表达Her2基因。免疫组化结果显示,Her2单克隆抗体Ab-3表达于SK-BR-3的胞浆及HT29的胞浆,判读结果结果均显示为弱阳性至强阳性不等。DLD-1、HCT8、HCT116、SW480的Ab-3染色均为阴性。Her2单克隆抗体CB11表达于SK-BR-3的胞浆及HT29的胞膜,判读后的结果均显示为2+至3+不等。DLD-1、HCT8、HCT116、SW480的CB11染色均为阴性。3.2 Her2基因过表达增强结直肠癌细胞增殖能力培养高表达Her2的稳定转染SW480细胞株,用CCK-8法连续检测5天的吸光度值,同样的样本做3个重复,检测转染后SW480细胞增殖能力的改变。结果发现,SW480 PIRES2-EGFP-Her2细胞的增殖能力较对照组增强,两组差异具有统计学意义(p<0.05)。3.3 Her2基因过表达促进结直肠癌细胞侵袭转移用Transwell小室检测Her2的稳定转染大肠癌细胞株SW480的侵袭能力的改变。将细胞种在8.0um孔径的上室内,36小时后,观察室细胞穿过聚碳酸酯膜进入下室的多少,了解肿瘤细胞的迁移能力。结晶紫染色后,倒置显微镜下取5个200倍视野计数,然后取平均数,SW480 PIRES2-EGFP-Her2与SW480PIRES2-EGFP空载体相比穿过基底膜的细胞数明显增加,统计学两组差异具有显著意义。3.4 RNAi沉默HERG2抑制HT29肿瘤细胞体外的侵袭能力经siRNA沉默Her2的大肠癌细胞株HT29侵入下层的细胞数较空白对照组及阴性对照组明显减少,侵袭能力明显降低。(三次独立试验,t检验,p=0.003),差异有统计学意义,而空白对照组与阴性对照组侵入下层的细胞数差异并无统计学意义(p>0.05)。4.结论Her2基因在结直肠癌细胞株HT-29中存在高表达,而DLD-1、HCT8、 HCT116、SW480中没有Her2基因的表达或仅有低表达。这一现象说明Her2基因在某些人类结直肠癌中可存在Her2基因扩增和过表达,进一步的结果表明,Her2基因在人类结直肠癌细胞过表达增强结直肠癌细胞增殖能力,增强结直肠癌细胞增殖能力。RNAi沉默HER2抑制HT29肿瘤细胞体外的侵袭能力。本部分的结果显示,Her2在人类结直肠癌有重要作用,Her2基因扩增和过表达会影响结直肠癌细胞株的增殖和侵袭能力。第二部分 兔单克隆抗体SP3和4B5对Her2蛋白在大肠癌表达的免疫组化结果评估1.研究背景和目的结直肠癌占全球每年新发癌症的8.5%。在美国结直肠癌是排名第二的与癌症的死亡率相关的疾病。人表皮生长因子受体2基因位于染色体17q12区域。它编码属于EGF/ERBB生长因子受体家族的跨膜糖蛋白。HER2/neu蛋白已被证明在乳腺癌和胃癌的辅助治疗的有效靶点过表达。虽然已经有多项关于大肠癌的Her2/neu蛋白表达的免疫组化染色相关研究。这些研究结果有明显不一致性,Her2/neu蛋白表达率涵盖了从0到84%,预后和Her2/neu蛋白过表达之间的关系也有不一致性。兔抗血清通常含有很高亲合力的抗体,而且与鼠抗血清相比,兔抗血清可以识别更多种类的免疫表位,有可能发展出更多、更具有特异性的新型抗体。兔单克隆抗体能够以识别许多在小鼠中不产生免疫的抗原。最近研制出的Her2兔单克隆抗体具有较高的亲和力和特异性。Her-2蛋白由三部分构成,包括细胞外的配体结合区、单链跨膜区以及细胞内的蛋白酪氨酸激酶区。Her2的兔单克隆抗体4B5是针对Her-2蛋白的细胞外结构域,另一种Her2的兔单克隆抗体SP3则是针对其细胞内的蛋白酪氨酸激酶结构域。本研究的目的是利用这两种兔单克隆抗体对Her2蛋白在大肠癌中的表达进行初步评估,并探讨Her2蛋白过度表达及其基因扩增与临床病理意义之间的关系。2.材料和方法2.1组织样本收集温州医科大学附属第一医院的外科病理数据库中获得的106例大肠癌患者标本,时间段为2003年到2007年间。’106例患者均行结肠切除术后进行临床资料的收集,包括性别、年龄、肿瘤分期、分级、有无复发、有无淋巴结转移和随访。患者术前均未接受放疗或化疗,病理分级是按照世界卫生组织(2010年)的标准定义,病理TNM分期是根据国际抗癌联盟(2002年)的TNM分期第六版的标准进行评估。死于其他原因而非大肠癌的患者均被排除在研究之外。所有手术标本手术切除组织后固定在10%中性福尔马林缓冲中。过夜固定后,将组织样本进行处理。2.2组织微阵列组织芯片由福尔马林固定和石蜡包埋块的标本构建而成。每一例标本选一张组织切片,随机标记三个有代表性的癌症病灶和一个正常黏膜位置。将标记好的点与组织蜡块相对应,每例取4个标记好的核心组织嵌入到打好孔的蜡块的组织芯片阵列中。然后将组织芯片蜡块切片用于免疫染色。2.3免疫组织化学(IHC)HER2/neu基因的兔单克隆抗体SP3检测根据试剂盒说明进行操作。将4μm厚的切片(10mmol/L的柠檬酸盐缓冲液,pH6.0)置于高压锅进行加热诱导抗原修复后脱蜡,并用二甲苯和乙醇水化。用3%的过氧化氢10分钟对内源性过氧化物酶的活性进行阻断。Ⅰ抗体(稀释为1：100)室温下孵育40分钟后,用EnVision Plus系统(DAKO)在室温下孵育30分钟进行检测。用3,3-二氨基联苯胺色原体检测反应产物。用苏木素进行衬染。HER2/neu蛋白的另一种兔单克隆抗体4B5于37℃温度下,染色缸内标准自动化流程16分钟进行抗原修复。预稀释到终浓度为6微克／毫升的特异性抗体。按说明进行操作。2.4荧光原位杂交(FISH)按试剂盒程序说明进行FISH法检测。简单来说,4mm切片进行脱蜡,然后用二甲苯和乙醇水化,并在80℃加热预处理10分钟。0.2%胃蛋白酶/0.01当量盐酸37℃处理30分钟,将载玻片于75℃孵育在ThermoBrite杂交液5分钟,之后于37℃孵育18小时。杂交后,载玻片2x SSC/0.3 NP-40在72℃进行2分钟漂洗,最后用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行复染。2.5评价IHC和FISH染色结果2.5.1免疫组化染色法的评价：对细胞膜和细胞质的免疫染色进行评分。细胞膜染色评分为0到3级：0,无反应或FISH分析显示在CRC中扩增的HER-2的同质的(a)和异质性(b)(红色信号簇),绿色信号代表第17号染色体的着丝粒,占到总细胞数的不足10%：1+,>10%的肿瘤细胞出现细胞膜微弱／轻微可察觉的染色或在细胞膜中有部分染色；2+,>10%的肿瘤细胞出现弱至中度程度完整/基底外侧细胞膜染色；3+,>10%的肿瘤细胞出现高强度完整/基底外侧细胞膜染色。细胞质的评分进行分级为阴性,弱(评分为1),强(评分为2)。2.5.2 FISH法的染色评价：根据ASCO/CAP指南进行评分。FISH结果报告以HER2/neu的平均计数除以平均17号CEP(染色体计数探针)计数。在20个非重叠的细胞内进行计数,包括每个核内HER2信号的平均数量和每个核CEP17染色体探针的平均数目。HER2/CEP17比率超过2.2被作为扩增,如HER2/CEP17比率小于1.8被认为没有扩增。如果该比例在模棱两可的范围(1.8-2.2),则另外计数20个细胞。2.6统计学处理使用Pearsonχ2法统计HER-2蛋白的高低与临床病理参数和5年癌症相关生存率的相关性。患者随访中位数为48.5个月(范围在10到81个月)。用Kaplan-Meier方法获得生存曲线。统计结果以P<0.05为有统计学显著差异。3.研究结果3.1兔单克隆抗体SP3和4B5免疫组化结果：在4B5抗体阳性表达的病例中,89%(16/18)显示细胞浆染色与膜细胞染色共存,所有的细胞免疫反应呈现弱阳性。7例SP3阳性表达病例中,有2例呈强染色。在本实验标本中有3例印戒细胞癌和4例粘液腺癌,在这些样本的细胞膜或细胞浆上并未检测到4B5和SP3的过度表达。有三例周围正常腺体4B5检测呈细胞膜弱染色(1+)。3.2 FISH法检测结果：全部TMA切片进行FISH法检测,并对所有Her2蛋白2+和3+染色切片进行分析。在全部3例Her2蛋白3+的切片中也表现出Her2基因扩增。对于评分2+,仅1例4B5免疫反应显示扩增。2例细胞浆强染色并未出现FISH扩增。Her2蛋白在细胞膜和细胞浆的过度表达与性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期之间并没有相关性(P> 0.05)。Her2蛋白(4B5染色)过度表达与整体存活率之间没有相关性(p=0.33)。4.结论Her2兔单克隆抗体4B5在检测大肠癌Her2/neu的表达中比SP3更为敏感。Nunes等人比较了在乳腺癌中Her2的单克隆抗体SP3、2个兔多克隆抗体(HercepTest,a0485),3个小鼠单克隆抗体(ncl-cb11, cm-cb11和4D5)的过表达,发现SP3比其他抗体而言表达更敏感,但特异性略差。我们的研究表明,随着敏感性的增高和染色强度增加,在检测HER2/neu过表达中,4b5可以用来减少假阴性。目前并无证据支持HER2/neu的过表达与肿瘤分级、PT, PN或生存率相关。一些研究表明细胞质Her2/neu染色与生存率有相关性,但在本研究中研究者并未观察到此现象。虽然用抗Her2/neu方法进行结直肠癌的治疗研究很少,基于其在胃癌治疗中的成功先例,我们也观察到有少数大肠癌患者(本实验中占2.8%)对于抗HER2/neu治疗有着良好疗效。尽管Her2基因扩增和蛋白过表达只发生在约3%的结直肠癌患者中,但这少量的患者仍有可能成为HER2靶向治疗的受益者。