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目的:原发性肝癌(Primary liver cancer,PLC)是一种恶性程度高、治愈率低的临床常见恶性肿瘤,居全球恶性肿瘤发病率的第六位,病死率的第三位。临床上原发性肝癌的主要治疗方法包括手术治疗、化疗、放疗、肝动脉化疗栓塞、分子靶向治疗、中医治疗等方法。由于肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的早期临床症状不明显,大部分患者就诊时已处于肝癌晚期,失去了手术机会。随着肝癌精确放疗技术的发展,放射治疗已成为晚期肝癌的主要治疗方法之一。放疗无异于电离辐射,肿瘤细胞受到射线照射后,会发生DNA损伤,损伤如果得不到及时精确地修复,就会出现细胞凋亡。肿瘤细胞具有高效的修复机制,在受到电离辐射时,细胞DNA双链断裂,继之启动修复机制。真核细胞DNA损伤主要存在两种修复方式:非同源末端连接(Non homologous end joining,NHEJ)和同源重组(Homologous recombination,HR)。在电离辐射引起的DNA损伤中,修复途径以非同源末端连接为主,抑制DNA修复途径有利于促进肿瘤细胞凋亡,提高肿瘤放射治疗的疗效。DNA依赖性蛋白激酶(DNA dependent protein kinase,DNA-PK)复合物是非同源末端连接修复途径的关键组分,且DNA-PK的催化亚单位(DNA dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)是其中的关键蛋白。目前多种DNA-PK抑制剂已用于肿瘤放疗增敏的实验研究,人工合成的小分子化合物NU7441作为DNA-PK的特异性抑制剂,在乳腺癌、肺癌、白血病、前列腺癌联合放疗的研究中表现出放射增敏效应。NU7026是另一种DNA-PK抑制剂。有关NU7441与肝癌关系的研究目前国内外尚乏报道,本研究以肝癌Hep G2细胞为研究对象,拟采用Cell Counting Kits-8(CCK-8)、Western blot、免疫荧光共聚焦、单细胞凝胶电泳及流式细胞术的方法,探讨NU7441对肝癌Hep G2细胞放疗敏感性的作用及其作用机制,为临床肝癌放疗增敏剂的开发与应用提供新思路。方法:1应用CCK-8实验检测NU7441在不同浓度(0.1μmol/L、1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L)及不同作用时间(12h、24h、48h和72h)下对Hep G2细胞增殖的影响,并绘制相应的作用曲线。2应用Western blot的方法检测①DNA-PKcs在正常肝细胞LO2、肝癌细胞Hep G2细胞及4Gy 60Coγ射线照射后的Hep G2细胞中的表达情况;②NU7441对4Gy 60Coγ射线照射后的Hep G2细胞中Ku70、Ku80、DNA-PKcs及p DNA-PKcs(S2056)蛋白表达的影响;③NU7441和另一种放疗增敏剂NU7026在相同条件对p DNA-PKcs(S2056)蛋白表达的影响。3应用单细胞凝胶电泳实验及免疫荧光共聚焦实验检测在NU7441有无的情况下,4Gy 60Coγ射线照射后的Hep G2细胞在不同时间点的DNA损伤修复情况。4应用流式细胞术检测Hep G2细胞在对照组(Control)、单纯照射组(IR)、单纯加药组(NU7441)、加药联合放射组(NU7441+IR)中,作用12h后,比较各组细胞在细胞周期的各时相中所占的比例。5采用统计学软件SPSS17.0进行实验数据分析,实验结果用均数±标准差表示。两独立样本采用t检验,多个独立样本的比较采One-Way ANOVA的分析方法,组间比较采用SNK方法,P<0.05视为有统计学差异。结果:1 CCK-8增殖实验表明:NU7441对Hep G2细胞的增殖具有一定的抑制作用,且具有浓度和时间依赖性;NU7441在浓度为5μmol/L及以上浓度下,这用抑制作用更加明显(P<0.05)。2 Western blot实验表明:①DNA-PKcs在LO2细胞、Hep G2细胞及4Gy 60Coγ射线照射后Hep G2细胞中的表达依次增高;②与未加药照射组相比,在NU7441作用下,4Gy 60Coγ射线照射后Hep G2细胞中Ku70、Ku80及DNA-PKcs的蛋白表达量没有明显变化,而磷酸化p DNA-PKcs(S2056)的蛋白表达量明显降低,NU7441的抑制作用主要是影响了DNA-PKcs的活性;③在相同实验条件下,NU7441组比NU7026组p DNA-PKcs(S2056)的蛋白表达量下降明显,NU7441对DNA-PKcs的活性抑制作用强于NU7026。3免疫荧光实验表明:Hep G2细胞在受照射后,细胞中的γH2AX焦点数量在一定时间范围在先增加后减少,在加入NU7441作用以后,γH2AX焦点数量也是先增加后减少,但与单纯照射组相比,γH2AX焦点数量下降的速率比照射组缓慢(P<0.05)。4中性单细胞凝胶电泳实验表明:Hep G2细胞在经过4Gy 60Coγ射线处理后,DNA发生损伤,表现为照射组彗星细胞的尾矩明显大于无任何处理组(P<0.05);经过4h的修复后,加入NU7441照射组的修复速度较单纯照射组减慢,表现为加药照射组的尾矩比照射组大(P<0.05)。5流式细胞术检测细胞周期的实验表明:与无任何处理Control组相比,IR组的G2/M期细胞的比例明显增加(P<0.05),NU7441组没有统计学差异(P>0.05);(NU7441+IR)组的G2/M期细胞的比例较IR组明显增加(P<0.05),且细胞凋亡率与Control组相比明显增加(P<0.05)。结论:NU7441对Hep G2细胞的增殖具有抑制作用,且这种作用具有时效和量效关系。NU7441通过抑制DNA-PKcs的活性,抑制辐射后Hep G2细胞DNA损伤的修复;同时通过引起细胞发生G2/M期的阻滞,诱导细胞凋亡,从而增加Hep G2细胞对辐射的敏感性,因此NU7441具有潜在放疗增敏作用。