γδT细胞是脊椎动物体内T淋巴细胞的一个重要亚群,它在抗肿瘤和免疫调节等方面均具有重要作用。Vγ9Vδ2 T细胞是人外周血中γδT细胞的主要亚群,可以通过T细胞受体(TCR)识别病原微生物的非肽类抗原和类似于自然杀伤的两种方式发挥抗肿瘤作用。本实验旨在构建Vγ9Vδ2 T细胞受体的融合片段,并通过在原核系统中大量表达Vγ9Vδ2蛋白为进一步研究γδTCR的晶体结构和生物学功能提供有力工具。目的:将Vγ9和Vδ2片段融合,探讨Vγ9Vδ2融合片段在不同载体中的表达情况,找到适合Vγ9Vδ2大量可溶表达的条件,从而为阐明Vγ9Vδ2 T细胞受体与抗原相互作用的结构基础提供条件,为探索γδT细胞新的配体提供有效工具,为临床更好地应用γδT细胞抗肿瘤和调节免疫功能提供理论基础和研究方向。方法:1.Vγ9Vδ2 T细胞受体基因全长的获取。从志愿者肘静脉抽取外周血,加入抗凝剂和PBS,与Ficoll分离液一起,通过梯度离心法分离单个核细胞。提取总RNA后,利用RT-PCR法分别扩增Vγ9Vδ2 T细胞受体的γ链和δ链基因全长。2.Vγ9和Vδ2融合片段的构建。用含有连接子序列的特异性引物分别扩增Vγ9和Vδ2片段,通过overlap PCR将两者融合。3.筛选适合Vγ9Vδ2融合片段表达的原核载体。将Vγ9Vδ2融合片段分别连接到pGEX-6p-1、pET28a、pET32a和pET43.1a,小量表达后检测Vγ9Vδ2的各个表达情况。4.Vγ9Vδ2-pET43.1a的大量表达和纯化。将小量表达情况较好的含有Vγ9Vδ2-pET43.1a质粒的大肠杆菌大量培养,裂解后通过Ni-NTA纯化Vγ9Vδ2的融合蛋白。结果:1.正确的Vγ9Vδ2 T细胞受体γ链和δ链序列全长。γδT细胞在人类外周血中占有的比例非常少,仅占总T淋巴细胞的5%左右。由于丰度较小,研究者大多先用诱导物刺激外周T淋巴细胞通过γδT细胞的扩增得到细胞株,然后提取RNA通过反转录PCR得到目的基因。而我们通过从外周血分离单个核细胞后直接提取RNA,经RT-PCR和胶回收后将目的片段连接到测序载体pEASY-T3上,经测序验证,正是Vγ9Vδ2 T细胞受体序列全长。2.Vγ9和Vδ2片段融合。γδT细胞受体是γ和δ两条链组成的异源二聚体。虽然两条链由V区、(D区,δ链)、J区和C区组成,但它们识别抗原和与抗原结合的部位均在V区。本实验中我们首先通过特异性引物扩增Vγ9Vδ2 T细胞受体的γ链V区片段Vγ9和δ链V区片段Vδ2,然后用连接子(Gly4Ser)4连接起来,使两者融合表达,这样既便于表达,又利于研究Vγ9Vδ2 T细胞受体的真实结构和功能。3.表达载体的优化。作为一种膜蛋白,Vγ9Vδ2 T细胞受体的表达情况一直是限制研究其结构和功能的一个瓶颈。它在很多载体和菌株中均不表达,或者以包涵体的形式表达。而研究其功能最需要的是要使之在上清中表达。我们依据实验经验和文献,对比不同的载体发现,与经典的pGEX-6p-1、pET28a和pET32a相比,Vγ9Vδ2在pET43.1a载体上表达量较多,而且定位在上清中。4.Vγ9Vδ2-pET43.1a的大量表达和纯化。将构建好的重组载体Vγ9Vδ2-pET43.1a转化感受态细胞BL21(DE3),大量培养后裂解菌体,离心取上清过Ni-NTA纯化目的蛋白。此时的目的蛋白与载体pET43.1a上的标签NusA融合在一起。SDS-PAGE和western证实已获得纯度较高的Vγ9Vδ2-NusA融合蛋白。5.Vγ9Vδ2-pET43.1a蛋白的酶切鉴定。将Vγ9Vδ2-NusA融合蛋白通过precission protease酶切分开,并通过Vδ2特异抗体验证酶切结果。结论:从人外周血中分离单个核细胞后直接提取RNA,反转录后通过PCR即可获得Vγ9Vδ2 T细胞受体两条链基因的全长序列。用连接子连接的Vγ9Vδ2重组片段在表达载体pET43.1a上有较好的表达,并能够与载体上的标签NusA很好地分离。