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目的:整合素(integr-in)是表达于细胞膜上,由α/β异二聚体通过非共价键结合形成的膜受体。整合素在免疫系统介导的炎症中起重要作用,可以介导炎症细胞向病灶部位的迁移和聚集。目前整合素家族有多个成员,其中α4β7在肠道炎症中起主导作用。目前已经确定与α4β7有关的肠道炎症疾病包括克罗恩病(Crohns disease),溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)等。α4β7的主要配体为黏膜地址素细胞粘附分子(mucosal addressin cell adhesionmolecule-1,MADCAM-1)。MAdCAM-1是选择性表达于黏膜淋巴器官高内皮静脉和肠道同有层静脉的一种跨膜糖蛋白分子。炎症情况下,多种细胞因子可以促进内皮细胞高表达MAdCAM-1,然后MAdCAM-1介导表达α4β7的白细胞向炎症部位迁移。无论是靶向整合素α4β7或者是MAdCAM-1都可以减轻肠道炎症程度。目前市场上并没有针对α4β7所介导炎症的特异性小分子化合物,I临床上使用的Natalizumab是一种人源化的单克隆抗体,靶点为α4亚基,主要用于治疗多发性硬化症和克罗恩病。本课题主要通过筛选影响α4β7和MAdCAM-1相互作用的化合物,其一为寻找特异性小分子抑制剂,开发临床用药,其二通过研究筛选的抑制剂或激动剂作用更好的了解α4β7信号转导通路,以便为开发更好的特异性药物提供理论基础。
方法:
1.用本实验室构建好的含有MAdCAM-1全长并融合有Fc片段的质粒pcDNA3-MAdCAM-1-Fc构建新质粒pEF-1-MAdCAM-1-Fc并建立293T稳转株。Western blot方法挑选并鉴定高表达MAdCAM-1-Fc稳转株。培养收集稳转株细胞培养基上清,通过Protein A柱子纯化MAdCAM-1-Fc融合蛋白。Protein A粗纯的靶蛋白含有杂蛋白,用AKTA Purifier进行进一步纯化。纯化的MAdCAM-1-Fc蛋白包被96孔ELISA酶标板用于基于细胞黏附实验的药物筛选:
2.基于细胞黏附实验的药物筛选选用高表达α4β7的RPMI8866细胞,用荧光染料BCECF-AM处理RPMI8866细胞,然后和不同化合物在包有MAdCAM-1-Fc的ELISA板里共孵育30分钟后洗去未结合或者若弱结合的细胞,最后用荧光仪器进行荧光读数;
3.对筛选出的候选药物通过细胞黏附实验进行IC50测定;
4.Flow chamber assay对细胞黏附实验筛选出的候选药物进行进一步的验证;
5.Western blot检测离子霉素在RPMI8866细胞中对磷酸化Paxilin和磷酸化FAK的蛋白量影响;
6.免疫共沉淀检测在离子霉素作用下talin-α4β7的相互作用状态。
结果:
1.经鉴定共筛出3株高表达MAdCAM-1-Fc的细胞株,分别为1F4,3C8和3F9;
2.通过对8个种类的药物库共计2100多种化合物的筛选,共找到五个候选化合物,分别为离子霉素(ionomycin),雷帕霉素(Rapamycin),AG879,Tyrphostin A9,SU1498。
3.细胞黏附实验测定四种化合物(Rapamycin为激活剂)的IC50分别为:离子霉素(5.5μM),AG879(14.18μM),TyrphostinA9(11.2μM),SU1498(15.12μM)。
4.Flow chamber assay实验中观察到在50μM的情况下,离子霉素对RPMI8866细胞和MAdCAM-1结合有抑制作用。而AG879,Tyrphostin A9和SU1498在10μM的情况下没有观察到明显的抑制现象,雷帕霉素在10μM的情况下没有观察到明显的激活现象。
5.western blot结果显示,离子霉素可以抑制paxilin和FAK的磷酸化。
6.免疫共沉淀结果显示离子霉素抑制了Talin与α4β7的结合。
结论:
1.离子霉素为一种特异性钙离子通道药,可以介导胞外钙离子向胞内转运,本实验发现胞内钙离了浓度可以训节整合素α4β7的活性。雷帕霉素在细胞黏附实验中观察到激活作用,在Flow chamber assay中没有观察到激活作用;AG879,Tyrphostin A9和SU1498在细胞黏附实验中观察到抑制现象,但在后续的Flow chamber assay中并没有观察到抑制作用。这可能归结于两个实验环境不一样,细胞黏附实验中药物在MADCAM-1配体存在的情况下和药物在37度培养箱中孵育30分钟,而Flow chamber assay中药物处理细胞是在没有配体存在的情况下进行的。其次,Flow chamber Assay是比细胞黏附实验灵敏度高得多的技术,这也是我们为何选择这种方法进行药物验证的原因。
2.研究证实Paxilin,黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)和Talin在整合素介导的黏着癍(Focal adhesion complex)形成中起着重要作用。而Paxilin和FAK的磷酸化可以反映其活性状态。离子霉素可以增强Paxilin的磷酸化而抑制FAK的磷酸化。说明离子霉素的抑制作用可能通过Paxilin和FAK起作用。
3.Talin含有可以直接和整合素beta7亚基相互作用的结构域,免疫共沉淀发现在离子霉素存在的情况下,talin和alpha4beta7的结合被抑制,说明离子霉素通过Talin干扰alpha4beta7的活性。