亚甲基二氧桥环是一类非常重要的结构单元,广泛存在于低等植物、海洋动物、真菌等来源的天然产物和药物分子中,并且这类化合物具有抗菌、抗病毒、抗癌等多种生物活性。到目前为止,五元及六元亚甲基二氧桥环的催化形成机理已被解析,但是对于独特的七元亚甲基二氧桥环的形成机制仍不明确。尾孢菌素是一种含有七元亚甲基二氧桥环的苝醌类色素,具有多种生物和光催化活性。虽然它已被分离和鉴定了几十年,但其生物合成途径,特别是独特的七元亚甲基二氧桥环的形成过程仍不清楚。为此,本论文通过体外重构、晶体结构解析与定点突变等手段阐明了尾孢菌素生物合成中七元亚甲基二氧桥环的形成机制,为解析含有亚甲基二氧桥环的天然产物的其他生物合成途径提供了分子基础。其主要研究内容如下:首先对尾孢菌Cercospora sp.JNU001的CTB9和CTB10进行基因敲除,实验结果表明,CTB9或CTB10可能负责尾孢菌素生物合成中七元亚甲基二氧桥环的形成。进一步的CTB9和/或CTB10细胞裂解液的体外实验显示,单独的CTB9可能足以催化七元亚甲基二氧桥环的形成。通过对CTB9的氨基酸序列进行保守性比对以及CTB9和CTB10的体外重构实验,证明了CTB9是一种非血红素Fe（II）-和α-酮戊二酸（α-KG）依赖的双加氧酶并且单独负责催化尾孢菌素中七元亚甲基二氧桥环的形成。为了更好地理解CTB9的催化机理,通过硒代甲硫氨酸标记、活性中心金属原子替换（将Fe替换成Cu）、辅因子类似物替换（将α-KG替换成N-草酰甘氨酸NOG）以及底物浸泡等策略,成功解析了CTB9在催化过程中的三种不同状态的蛋白质晶体Se-CTB9（2.29（?）,7EUS）、CTB9·Cu·NOG（2.49（?）,7EUT）、CTB9·Cu·NOG·pre-cercosporin（2.20（?）,7EUU）。通过比较不同状态下底物结合位点周围氨基酸构象的变化,揭示了CTB9在尾孢菌素生物合成中对七元亚甲基二氧桥环形成的潜在催化机制,为阐明CTB9的催化机理提供了坚实的基础。通过CTB9·Cu·NOG·pre-cercosporin晶体结构可以清晰地观察到底物pre-cercosporin与CTB9周围氨基酸残基之间详细的相互作用,并结合相应氨基酸的序列保守性,对关键氨基酸进行定点突变,发现这些氨基酸残基（Asp172,Gln173,Arg181,Asn248,Arg313）的突变完全失去了原有的催化能力,表明以上关键氨基酸的相互作用有利于促进底物形成正确的构象,揭示了它们在尾孢菌素生物合成中在七元亚甲基二氧桥环形成的重要性,尤其是His234在稳定pre-cercosporin的结构中起着关键作用。最后根据实验结果、细胞色素P450催化五元或六元亚甲基二氧桥环的形成机理以及其它Fe（II）/α-KGDs催化反应的机理,提出了合理的CTB9的催化机制来揭示尾孢菌素中七元亚甲基二氧桥环的形成过程。