肝移植是目前公认的治疗终末期肝病的有效方法。随着肝移植技术的逐渐成熟,移植肝的排斥问题成为亟待解决的一大难题。肝移植术后免疫抑制剂的应用为移植肝的长期存活及功能发挥提供了较有力的保障,然而,长期使用免疫抑制剂常引发一系列的问题,如经济负担,过度免疫抑制,病毒感染,恶性肿瘤及各器官的损害。给患者带来了十分不利的影响。因此,人们在致力于寻找另一种有效的方法,使移植器官能在不应用免疫抑制剂的情况下长期、有功能的存活。近年有学者发现:体外及体内实验中间充质干细胞（Mesenchymal StemCelIs,MSC）可以抑制T细胞的增殖,诱导免疫耐受。骨髓间充质干细胞（BoneMarrow Mesenchymal Stem Cells,BMSC）是MSC中最重要的的一种。并且由于其低免疫原性和体内外的高增殖和多向分化潜能,甚至可以用异基因BMSC移植来诱导免疫耐受。其原因可能与MSC的MHC抗原表达异常,具有调节宿主树突状细胞和T细胞的功能等因素有关。既往有研究将供体BMSC于肝移植同期输注给受体大鼠,但是移植肝存活时间有限,难以诱导免疫耐受。有报道在免疫抑制剂的作用下,同种脾脏或者脾细胞移植可诱导免疫耐受,使移植物长期存活。其可能机制为建立受体内的高嵌合体状态而发挥一系列的作用。本实验从临床实际角度,拟从以下三方面观察研究同期输注同基因BMSC联合供体脾组织移植对大鼠移植肝抗排斥作用:1、建立稳定的大鼠原位肝移植急性排斥反应模型;2、受体Lewis大鼠骨髓间充质干细胞体外培养、扩增、鉴定及功能特性的研究,观察其体外对同基因T细胞增殖的作用;3、在前两方面研究的基础上进一步研究同期输注同基因BMSC联合供体脾组织移植对大鼠移植肝抗排斥的作用并阐明其机理。第一部分大鼠原位肝移植急性排斥反应模型的建立目的:建立稳定的大鼠原位肝移植急性排斥反应模型。为进一步的实验研究奠定技术基础。方法:1采用改良“二袖套法”,利用封闭群SD大鼠进行大鼠肝移植模型技能训练。2建立DA-Lewis组合的肝移植模型,统计切肝、修肝和无肝期及受体手术时间;术后的生存率和生存时间以及死亡原因。结果:1技能练习阶段受体大鼠的存活时间大多不超过48小时。此时段主要为手术操作技能和围手术期管理积累经验。2正式实验行20例DA-Lewis大鼠原位肝移植,3例于术后48小时内死亡,手术成功率达85%,死亡的3例中:1例死于肝上下腔静脉吻合口出血,1例死于空气栓塞,1例因门静脉袖套管脱落死亡。3正式实验17例手术成功的受体中位生存时间为7天。结论:大鼠原位肝移植模型制作难度较大,影响因素众多。熟练的显微外科技术,完善的围手术期处理及耐心细致的操作是决定此模型制作成功的关键。第二部分Lewis大鼠骨髓间充质干细胞的原代分离、体外培养、扩增、鉴定及功能特性的研究目的:采用贴壁细胞筛选法进行Lewis大鼠BMSC的分离、培养,并进行鉴定和功能研究,为进一步使用BMSC诱导大鼠异体肝移植免疫低反应提供实验依据。方法:1 Lewis大鼠BMSC的提取与培养传代:无菌取4周龄Lewis大鼠胫骨和股骨骨髓,制成细胞悬液,离心后重复洗涤3次。收集沉淀的细胞,调整细胞浓度为6×10⁵ cells/ml接种。置于37℃、5%CO₂培养箱,到第5d时首次换液,以后每2-3d换液1次。再以1.5×10⁴ cells/cm²的接种密度传代培养,培养条件与原代培养相同。按此方法传代培养至第三代。2显微镜观察:每天用倒置显微镜观察、摄片,绘制生长曲线。3 BMSC的免疫组化鉴定和表型分析:取第三代BMSC行CD34、CD44免疫组化法鉴定;利用流式细胞仪进行BMSC特征性抗体CD34、CD44、CD45、CD90的表型鉴定。4混合淋巴细胞培养MLC:取正常DA和Lewis大鼠脾脏,尼龙毛吸附法制备纯化T细胞,分别作为刺激细胞和反应细胞。于反应细胞培养板中加入丝裂霉素C处理过的2.5×10⁵个BMSC作为实验组,只加培养液的孔作为空白孔;单纯刺激细胞加反应细胞为空白对照;单纯加BMSC为调控细胞对照。计算细胞生长抑制率。5 BMSC的培养液细胞因子检测:在BMSC原代培养至第3d、5d,收集半量换液之离心上清,酶联免疫法（ELISA）测定IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ水平。结果:1第三代BMSC生长呈单层,细胞相互间紧密贴附,单个细胞呈狭长梭形,排列有明显方向性。细胞排列呈旋涡状、网状,复层生长的细胞形态呈多边角型。其生长曲线近似“S”形。2免疫组化BMSC的CD34表达阴性,而BMSC相对特异性标记物CD44表达阳性。流式细胞仪检测显示CD34、CD44、CD45、CD90细胞阳性率分别为7.9%±1.3%、89.5%±4.5%、4.3%±0.5%、95%±3.8%,说明分离获得的细胞符合BMSC的特点。3混合淋巴细胞培养中:实验组吸光度A值为0.769±0.154,对照组A值为1.479±0.126,抑制率为48.05%。表明当Lewis鼠BMSC与T细胞比值为1∶1时,在MLC体系中,T淋巴细胞增殖明显受到抑制。4 BMSC离心上清中未检测到IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ。结论:1利用贴壁筛选法获得BMSC细胞,操作简便,效果确切。2实验过程中的细致操作和无菌观念是细胞培养成功的关键3本实验从形态学,免疫组化,细胞表型,功能活性等方面进行全面鉴定,证实了分离、培养体系的正确性。满足了进一步实验的要求。第三部分输注同基因骨髓间充质干细胞联合脾组织移植对大鼠移植肝的抗排斥作用的机制目的:肝移植同期输注同基因BMSC联合供体脾脏组织移植,诱导受体产生免疫低反应降低移植肝的排斥反应。观察此方法对于异基因大鼠移植肝的保护作用,探讨BMSC联合脾组织移植共同抑制排斥反应的机理。方法:1以DA大鼠作为供体,Lewis大鼠作为受体的大鼠肝移植急性排斥反应模型建立,见第一部分。受体（Lewis大鼠）来源的BMSC获取、鉴定,见第二部分。2实验分组将受体Lewis大鼠以数字表法随机分为4组,每组24只。（1）对照组（A组）:行DA-Lewis大鼠原位肝移植,不做其它处理。（2）环孢素组（B组）:行DA-Lewis大鼠原位肝移植于术后第1d开始给予环孢素A灌胃处理,10mg/kg/d,直至其死亡。（3）干细胞组（C组）:行DA-Lewis大鼠原位肝移植,同期输注同基因Lewis大鼠骨髓间充质干细胞2×10⁶cells,共1ml。（4）联合移植组（D组）:在干细胞移植组的基础上同期移植DA大鼠脾组织（量约占全脾的25%）于受体大网膜。3各组留6只大鼠观察术后生存期,分别于移植后3d、7d和10d抽血检测血清ALT,AST,TBIL水平,ELISA法测定IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ水平;用流式细胞仪检测肝细胞和肝组织内Th1细胞凋亡情况,于术后7d检测Lewis大鼠脾脏内嵌合体的水平;肝组织行HE染色,进行光镜和电镜观察,移植脾组织行病理观察。结果:和A组比较,B、C组生存期明显延长（P＜0.05）,D组高于其他各组（P＜0.05）;移植术后各组大鼠血清生化检查:在移植术后3、7、10d,B、C、D肝功能组逐渐好转,A组ALT、AST、TBIL急剧上升,与存活时间表现一致。A组IL-2、IFN-γ明显高于其它各组（P＜0.05）,D组与B、C组比较,下降更明显（P＜0.05）;IL-4、IL-10值A组明显低于其它组,D组最高（P＜0.05）。B、C和D组的肝细胞凋亡率明显低于A组（P＜0.05）,C、D组肝组织内Th1细胞凋亡比率低于A、B组,（P＜0.05）。嵌合体水平D组高于其余各组（P＜0.05）,肝脏病理示术后7d、10d,A组的Banff评分明显高于B、C、D组（P＜0.05）,B、C、D 3组无明显差异（P＞0.05）。D组脾组织在术后30d、60d有不同程度的再生。结论:（1）BMSC可以改善大鼠移植肝肝功能、降低移植肝排斥病理评分,并延长其生存期。（2）BMSC可诱导大鼠肝组织内Th1细胞凋亡,降低移植肝细胞的凋亡率,减轻肝移植后的排斥反应。（3）脾组织移植明显提高了受体内嵌合体的水平,明显延长了大鼠移植肝存活时间,对BMSC抑制肝移植后急性排斥反应起协同作用。（4）异体脾组织在受体内得到了一定程度的再生。