漆酶(p-diphenol:oxygen oxidoreductase； EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，广泛分布于高等植物、真菌和细菌中。由于漆酶本身有着广泛的底物作用范围，加上漆酶介体的使用，使漆酶在纺织、造纸、环境保护、生物炼制、及有机合成等领域都有着广泛的应用。这些应用实现的前提条件是，必须有廉价、且具有优越催化特性的漆酶酶源。本课题是在已经构建的漆酶酵母工程菌的基础之上展开的，主要研究内容包括以下几个方面。　　 本文主要采用以下四种方法建立突变体库：易错PCR，EMS、NTG随机诱变，定点饱和诱变，以及交错延伸重组。采用降低固体琼脂筛选平板的pH和96孔板液体发酵培养和酶标仪检测酶活性相结合的高通量筛选方法对突变体库进行筛选。在以EMS随机诱变建立的突变体库中筛选到一株总酶活提高5倍的菌株命名为PPM5，在这株菌中漆酶的表达量和野生株相比提高3.7倍，在酵母中表达量达到144mg I-1，Kcat提高1.4倍，其漆酶表达活性达到30Uml-1。通过和原始漆酶相比较发现诱变酶对于ABTS和愈创木酚的Km，最适pH和最适反应温度都没有发生改变。经克隆测序得到诱变株的漆酶基因序列，有4个氨基酸发生了改变，分别为Gly160Asp，Ala167Thr，Gly174Asp，and Glu234Gly，都远离漆酶的活性中心，以PPM5的漆酶基因为基础，分别对其Asp160，Thr167，Asp174位进行定点饱和突变，经筛选没有酶活提高的突变子。以PPM5的漆酶基因作为诱变的出发基因，以亚硝基胍诱变建立突变体库，经筛选得到一株酶活提高1.5倍的菌株，此突变株命名为PPM6，在酵母发酵液中漆酶的活性达到45Uml-1，经发酵条件的优化最高酶活在培养96个小时后达到66Uml-1。PPM6的蛋白表达量没有变化，其酶活提高主要是由于Kcat提高所致。经测序得到PPM6的漆酶基因序列，相对于PPM5，有两个位点发生了改变，137T-C，704 G-A，其中，第二个位点是有义突变，将Gly234Glu，是PPM5的回复突变。以漆酶原始基因和PPM6的漆酶基因交错延伸重组建立的DNA重组突变库和易错PCR建立的突变体库，没有筛选到酶活提高的菌株。　　 为了获得漆酶的高效表达菌株，构建了漆酶的诱导、组成。诱导表达系统。通过PCR扩增出PPM5漆酶基因，连接到酵母诱导表达载体pPIC9K，然后电击转化宿主菌Pichia pastoris GS115，构建漆酶的诱导表达系统命名为GS115/A；同时将诱导漆酶表达载体电击转化到PPM5，构建漆酶组成.诱导表达系统，命名为GS115/GA。为了提高漆酶诱导型表达水平，还构建了漆酶在自身信号肽、α信号肽，以及自身信号肽前插入1-3个氨基酸引导下的表达。结果表明诱导型表达载体，在漆酶自身信号肽的表达量是α信号肽的5倍，自身信号肽下的表达菌株命名GS115/As，自身信号肽前插入1-3个氨基酸降低了漆酶的表达水平；还研究了ATG前的非编码序列，对漆酶组成型表达的影响，结果表明非编码序列对漆酶表达没有影响。　　 我们还优化漆酶酵母组成型PPM5、诱导型GS115/As、组成－诱导型表达系统GS115/GA的三角瓶发酵条件，结果表明在30℃摇瓶培养时，在0.6mM铜离子、YPD(1.2％，1.5％葡萄糖)、每隔24h添加2.5％甲醇的条件下，培养144h，GS115/A。和GS115/GA的漆酶活性分别达到40UmL和56UmL-1；组成型表达系统PPM5菌株在0.6mM的铜离子浓度下，在1％乙醇的条件下，培养96h，漆酶最高活性达到45UmL-1，乙醇的添加使组成型表达的漆酶活性提高1.5倍。我们的研究结果表明对于GS115/As，GS115/GA菌株，pH，甲醇浓度以及铜离子浓度对漆酶的表达影响较大。对于PPM5，乙醇明显的提高了漆酶的活性。　　 以靛蓝胭脂红为筛选介体的降解染料，从14种化合物中筛选出间苯三酚、麝香草酚、紫尿酸作为漆酶降解染料的介体。在这三种化合物存在的条件下，在一个小时内，靛蓝胭脂红脱色率可以达到90-100％，将这三种化合物作为漆酶降解其它四种染料的介体。结果表明紫尿酸是降解葸醌类染料RBBR和三苯甲烷类染料CBB以及重氮类染料酸红的有效介体，在它存在的条件下，四种染料的脱色率都在70％以上。麝香草酚能够促进RBBR和杂环类染料天蓝的降解。间苯三酚对RBBR、CBB、和酸红、和天蓝A的降解没有促进作用。介体的浓度、pH以及铜离子浓度都对染料的脱色有影响。实验结果表明漆酶介体，促进了漆酶对染料的降解，漆酶系统对染料的脱色能力取决于染料结构、介体的类型、以及脱色条件。