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目的:活性氧(ractive oxygen species,ROS)的过量生成在急性肝损伤的发生发展中起着重要作用。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase,NOX)是炎症中ROS爆发产生的主要氧化酶,但NOX在急性肝损伤中的病理学意义及NOX抑制剂的药理学作用尚不清楚。本文在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)/右旋半乳糖胺(D-galactosamine,D-Gal)诱导的小鼠急性肝损伤模型中探讨了NOX及其抑制剂在急性肝损伤中的作用及相关机制。方法:采用LPS(10μg/kg)/D-Gal(700mg/kg)腹腔注射,在雄性BALB/c小鼠中复制急性肝损伤模型,为明确LPS/D-Gal诱导的急性肝损伤中ROS的水平是否发生变化,我们分别在LPS/D-Gal注射后0h、2h、4h及6h处死小鼠并采集肝组织样本,用ROS荧光染料DHE检测ROS的水平。为探索ROS的变化是否由NOX催化,我们将NOX抑制剂Apocynin于LPS/D-Gal注射前0.5h(简称Apocynin预处理,后同)腹腔注射,我们在LPS/D-Gal注射后6h,检测小鼠肝脏ROS水平的变化,同时还检测了DNA/RNA氧化损伤标志物8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-OH-dG)、蛋白质氧化损伤标志物蛋白质羰基(C=O)以及脂质氧化损伤标志物硫代巴比妥酸活性物质(thiobarbituric acid reactive substance,TBARS)的变化。为探讨NOX是否参与肝损伤的发生发展,我们也对Apocynin处理的小鼠血浆转氨酶、肝组织形态学、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)及生存率做了分析。我们之前的研究发现LPS/D-Gal诱导的急性肝损伤与肝细胞大量凋亡密切相关,为了进一步揭示NOX是否通过调节肝细胞凋亡而影响急性肝损伤的发生发展,我们测定了凋亡相关蛋白caspase级联通路中的关键蛋白caspase-3、caspase-8及caspase-9在Apocynin处理小鼠肝组织内的活性变化,也采用Western Blot技术分析了凋亡标记蛋白,如:被切割的半胱氨酸/天冬氨酸蛋白水解酶片段(cleaved caspase-3)、被切割的DNA修复酶片段(cleaved PARP)的表达情况,还采用TUNEL染色分析了肝组织细胞的凋亡情况。为了进一步深入研究NOX调节肝细胞凋亡的可能机制,我们检测了对氧化应激敏感的腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)的激活情况,同时还检测了凋亡调控蛋白c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)的激活情况。为进一步探索抑制NOX在急性肝损伤中是否有治疗性临床意义,我们在LPS/D-Gal注射2h,即急性肝损伤发生后,腹腔注射Apocynin(简称Apocynin后处理,后同),然后进行转氨酶、生存率等检测。此外,在上述模型中,我们用ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC),在LPS/D-Gal注射2h后进行腹腔注射(简称NAC后处理,后同),通过对血浆转氨酶测定及肝组织形态学分析,以进一步确认ROS在LPS/D-Gal诱导的急性肝损伤发生发展中的重要作用。最后,为了确认JNK在该模型中发挥调节细胞凋亡的中心作用,我们用JNK抑制剂SP600125,在LPS/D-Gal注射2h后进行腹腔注射(简称SP600125后处理,后同),同时检测肝细胞凋亡及转氨酶等。结果:(1)LPS/D-Gal处理可时间依赖性地增加小鼠肝组织内ROS水平。(2)NOX抑制剂Apocynin预处理抑制了LPS/D-Gal诱导的ROS的产生,同时减少了氧化损伤标志物8-OH-dG、C=O和TBARS的产生。(3)Apocynin预处理抑制了LPS/D-Gal诱导的转氨酶升高,减轻了肝脏组织学异常,抑制了炎性细胞因子TNF-α的产生,更重要的是,增加了LPS/D-Gal诱导急性肝损伤的生存率。(4)Apocynin预处理阻断了caspase级联反应的激活,同时也减少了TUNEL阳性细胞的数量,通过Western Blot分析发现LPS/D-Gal诱导的凋亡标记蛋白caspase-3片段及PARP片段的上调也被Apocynin预处理所抑制,并且AMPK与JNK蛋白的激活(磷酸化)也被Apocynin预处理所抑制。(5)Apocynin后处理得到与预处理相似的结果,也减少了LPS/D-Gal诱导的ROS的产生、减少了肝细胞凋亡、降低了转氨酶并且也增加了急性肝损伤小鼠的生存率等。(6)ROS清除剂NAC后处理也抑制了AMPK及JNK的激活,同时抑制了caspase级联反应的激活,减少了肝细胞凋亡,并且降低了血清转氨酶,减轻了肝损伤。(7)SP600125后处理抑制JNK,减少肝细胞凋亡,降低血浆转氨酶,减轻了肝损伤。结论:本研究提示在LPS/D-Gal诱导的急性肝损伤中,ROS主要在在急性肝损伤晚期大量生成,且NOX是ROS的重要来源;NOX催化生成的大量ROS一方面直接造成组织细胞氧化损伤,另一方面通过激活AMPK/JNK通路增强细胞凋亡信号,从而诱导广泛的肝细胞凋亡,这可能是LPS/D-Gal诱导急性肝损伤发生发展的重要机制;NOX抑制剂Apocynin可能在炎症性肝病的治疗中具有潜在的应用价值。