过去的几十年中麻醉专业已经把它的临床实践从大部分局限在手术室扩展到包括“急性疼痛治疗”、“术后监护治疗”、“重症监护治疗”、“慢性疼痛治疗”、“睡眠治疗”和“姑息治疗”在内的围术期医疗范畴。最近麻醉学杂志上有一篇文章讨论将“围术期医学”加到“麻醉科”的名称中并决定如何扩展最新的培训课程[1]。“麻醉科”更名为“麻醉及围术期医学科”已达成专家共识。而在中国刘进也提出了“改善围术期患者的转归是麻醉医生始终不渝的使命”。麻醉药物及方法的选择对患者术后的转归有重要影响。肿瘤手术患者术中都需要接触到麻醉药物。麻醉药物对肿瘤的生物学特性影响最近越来越受到关注。最近有研究表明异氟醚可促进卵巢癌的增殖[2],同时异氟醚还可促进前列腺癌的增殖、迁移及化疗耐药[3]。2013年麻醉学杂志上发表的异氟醚促进肾细胞癌的增殖及迁移受到了广泛的关注及讨论[4]。而之前的研究表明常用吸入麻醉药如氟烷、七氟醚及异氟醚对肿瘤细胞增殖有抑制作用,且与处理时间密切相关[5]。以上结论的差异可能是由于吸入麻醉药处理的时间及与肿瘤细胞种类的不同导致。又有研究显示七氟醚可拮抗顺铂对艾氏腹水细胞瘤的DNA毒性。骨肉瘤是一种高致残率的恶性肿瘤。其手术常用麻醉药物为七氟醚和异氟醚。而七氟醚、异氟醚对骨肉瘤生物学特性及化疗敏感性的影响并未见相关报道。本课题将应用肿瘤生物学常用实验技术及分子生物学常用实验方法对吸入麻醉药对骨肉瘤MG63细胞增殖凋亡及对顺铂化疗敏感性的影响进行研究,并检测相关蛋白分子水平的变化,探讨可能的相关机制。实验一七氟醚、异氟醚对骨肉瘤MG63细胞增殖、克隆形成及凋亡的影响目的:观察不同浓度七氟醚、异氟醚对骨肉瘤MG63细胞增殖、克隆形成能力及凋亡的影响。方法:将MG63细胞从液氮中取出,迅速放入37℃水浴锅中,复苏细胞,常规培养细胞。实验分七组:对照组(C组):充入含5%CO2、21%O2、74%N2混合气体,处理4 h,七氟醚组(S1组):1.7%七氟醚的上述混合气体处理4 h,七氟醚组(S2组):3.4%七氟醚的混合气体处理4 h,七氟醚组(S3组):5.1%七氟醚的混合气体处理4 h,异氟醚组(I1组):充入含有1.3%异氟醚的混合气体处理4 h,异氟醚组(I2组):2.0%异氟醚混合气体处理4 h,异氟醚组(I3组):2.6%异氟醚混合气体处理4 h。用MTT法检测各组细胞的增殖抑制率,平板克隆形成实验检测各组细胞的克隆形成能力,用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。结果:1.MTT法检测显示:与对照组相比,七氟醚、异氟醚处理组增殖抑制率增高(P<0.05),其中S3组和I3组增殖抑制率高于其它各组,差异具有统计学意义(P<0.05),提示七氟醚、异氟醚对骨肉瘤MG63细胞增殖有抑制作用,其中高浓度的吸入麻醉药抑制作用更明显。2.平板克隆形成实验:与对照组相比,各浓度七氟醚、异氟醚组克隆形成率要低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),但组间比较显示各浓度七氟醚组和异氟醚组无差异。提示七氟醚、异氟醚对骨肉瘤MG63细胞克隆形成有抑制作用,但与浓度关系不大。3.流式细胞术结果:与对照组相比,各浓度七氟醚、异氟醚组细胞凋亡率无差异(P>0.05),组间多重比较显示,各组间细胞凋亡率无统计学意义(P>0.05)。提示各浓度七氟醚、异氟醚并不促进骨肉瘤MG63细胞的凋亡。结论:七氟醚、异氟醚对骨肉瘤MG63细胞增殖有抑制作用,高浓度抑制作用更明显;七氟醚、异氟醚对骨肉瘤MG63细胞克隆形成能力有抑制作用,但与浓度关系不大;七氟醚、异氟醚对骨肉瘤MG63细胞凋亡无影响,提示七氟醚、异氟醚对MG63细胞增殖抑制作用与凋亡无关。实验二七氟醚、异氟醚对顺铂诱导的骨肉瘤MG63细胞凋亡的影响及相关机制目的:观察2.5%七氟醚、2.0%异氟醚对顺铂诱导的MG63细胞凋亡率的影响。方法:同实验一。实验分为六组:对照组,只充入含5%CO2、21%O2、74%N2混合气体,处理4 h;七氟醚组,含2.5%七氟醚的混合气体处理4h;异氟醚组,含2.0%异氟醚的混合气体处理MG63细胞4h;顺铂组:用终浓度为10mg/L的顺铂处理MG63细胞24h;顺铂+七氟醚组,加入终浓度为10mg/L的顺铂处理24h另于开始4h内同时给予2.5%七氟醚处理;顺铂组+异氟醚,加入终浓度为10mg/L的顺铂处理24h另于开始4h内同时给予2.0%异氟醚处理。MTT法检测各组细胞活力,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot检测各组细胞p-Akt、NF-κB P65、Hif-1α、Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结果:1.MTT法结果:与对照组相比,各组细胞吸光度值降低(P<0.05),其中顺铂组、顺铂+七氟醚组、顺铂+异氟醚吸光度值明显低于其它各组(P<0.05),提示七氟醚、异氟醚、顺铂对MG63细胞活力有影响,顺铂对其活力影响更明显;与顺铂组相比,顺铂+七氟醚组、顺铂+异氟醚吸光度值高于单纯顺铂组,差异具有统计学意义(P<0.05),提示七氟醚、异氟醚对顺铂对骨肉瘤MG63细胞毒性作用有拮抗作用。2.流式细胞术检测结果显示:与对照组相比,顺铂组、顺铂+七氟醚组、顺铂+异氟醚组细胞凋亡率明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),提示顺铂诱导了骨肉瘤MG63细胞凋亡;与顺铂比相比,顺铂+七氟醚组、顺铂+异氟醚细胞凋亡率降低于(P<0.05),提示七氟醚、异氟醚对顺铂诱导MG63细胞凋亡有拮抗作用。3.Western blot结果显示:与顺铂组相比,顺铂+七氟醚组、顺铂+异氟醚组NF-κB P65、Hif-1α、Bcl-2表达升高,Bax表达减少,差异具有统计学意义(P<0.05),提示七氟醚、异氟醚促进了NF-κB的活化,提高了Hif-1α表达水平,并改变了凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达,七氟醚、异氟醚对骨肉瘤MG63对顺铂化疗敏感性的影响可能与这些蛋白表达变化有关。p-Akt蛋白表达在各组间并无差异(P>0.05)。结论:七氟醚、异氟醚对骨肉瘤MG63活力有影响,七氟醚、异氟醚拮抗顺铂对骨肉瘤MG63细胞的毒性作用;七氟醚、异氟醚对顺铂诱导的MG63细胞凋亡有拮抗作用。七氟醚、异氟醚降低了骨肉瘤MG63细胞对顺铂化疗敏感性可能与活化NF-κB,促进Hif-1α表达及改变凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达水平有关。