论文部分内容阅读
小麦（Triticum aestivum L.）是世界范围内种植最广泛的粮食作物之一。低温严重影响植物的生长发育和生产力。我国黑龙江省地区冬季漫长、寒冷干燥,平均最低温度可达-30℃,严重限制了小麦的推广种植。东农冬麦1号（Dn1）是东北农业大学研发的首例可以适应低温生长的强抗寒性冬小麦品种,其返青率可达85%以上,对其抗寒分子机制的研究有助于提高土地利用效率,从而实现两年三熟的栽培模式扩大冬小麦的种植面积和产量。丝裂原活化蛋白激酶级联（Mitogen activated protein kinase,MAPK）作为广泛存在于植物体内的一条高度保守的信号转导模块,主要由MAPKKK（MEKKK）、MAPKK（MEKK）、MAPK（MPK）三部分组成,它们通过将环境信号逐级放大并传递到下游转录因子或效应蛋白的靶点上,从而调节多种细胞反应。研究表明,MPK位于整个级联途径的最下游,在植物抵御低温胁迫和激素响应过程中发挥重要作用。课题组前期构建Dn1分蘖节磷酸化蛋白组学数据库发现,低温胁迫下Dn1中MPKs的蛋白水平发生显著的变化。本研究选取差异表达的TaMPK3,利用生物信息方法对TaMPK3基因特性、蛋白特性、系统发育树、启动子元件等进行分析和预测;ELISA法检测低温胁迫下Dn1中MPK酶活性;q RT-PCR分析在大田自然降温条件下,不同外源激素处理下Dn1叶片和分蘖节中TaMPK3的表达模式;构建过表达TaMPK3载体并遗传转化拟南芥获得T3代纯合植株,鉴定TaMPK3的抗寒生物学功能;对TaMPK3蛋白进行亚细胞定位;酵母双杂（Y2H）和双分子荧光素互补（Bi FC）技术验证TaMPK3与Ta ICE41是否存在体外和体内相互作用。本研究为解释MPK3调控冬小麦抗寒分子机制提供理论依据,主要研究结果如下:（1）生物信息学分析表明:TaMPK3（Traes CS4D02G198600）CDS为1110 bp,编码369个氨基酸,含有4个内含子、5个外显子,位于小麦4D染色体344940376..344943564上。TaMPK3蛋白是不稳定的亲水性蛋白,不存在跨膜结构域。TaMPK3与其它物种MPK3蛋白具有较高的结构保守性,含有TEY激活环基序,属于TEY型MPK。TaMPK3与水稻和玉米MPK3在系统发育进化树聚类为同一分支,亲缘关系较近;TaMPK3与水稻、玉米、大豆、甘蓝型油菜、拟南芥的MPK3蛋白有9个相同的motif基序,进一步支持进化树的分析结果。TaMPK3启动子序列含有与CBFs及CORs相同的DRE脱水反应顺式作用元件。（2）Dn1 MPK酶活:随温度的降低,Dn1分蘖节中MPK酶活呈先降后升的变化趋势,在-25℃时达到峰值;Dn1叶片中MPK酶活呈先升后降的变化趋势,在-10℃时达到峰值。（3）低温胁迫下Dn1中TaMPK3的表达模式表明:随着温度的降低,Dn1分蘖节中TaMPK3相对表达量呈逐渐升高的变化趋势,-25℃时达到峰值;叶片中TaMPK3相对表达量呈先升后降的变化趋势,0℃时达到峰值。外源SA处理显著提高了0℃及以下低温Dn1分蘖节和叶片中TaMPK3的相对表达量（-25℃分蘖节除外）,且分蘖节和叶片中TaMPK3的表达量均在-10°C达到峰值;外源ABA处理降低了低温胁迫下Dn1分蘖节和叶片中TaMPK3的相对表达量;外源Me JA处理同样降低了低温胁迫下Dn1分蘖节中TaMPK3的相对表达量,显著提高了叶片中TaMPK3在5°C和0°C时的相对表达量。（4）对4周苗龄野生型（WT）和过表达TaMPK3基因的拟南芥植株（ox-TaMPK3-6、ox-TaMPK3-8）抗寒功能鉴定表明:4℃冷驯化3 d、-10℃低温处理2 h、恢复至室温24℃培养3 d后,WT植株叶片明显变白和枯萎,过表达植株表现出更强的冷冻耐受性。低温处理显著降低了ox-TaMPK3-6和ox-TaMPK3-8植株的相对电导率、丙二醛（MDA）含量、过氧化氢（H2O2）和超氧阴离子（O2-）含量,显著提高了脯氨酸（Pro）含量和4℃下叶片中MPK酶活性。与24℃相比,过表达TaMPK3基因显著提高了拟南芥植株在4℃和-10℃下冷响应基因At COR15A、At COR47、At RD29A和At KIN1表达量,显著提高了-10℃下At ICE1和At CBFs的表达量。（5）亚细胞定位表明:TaMPK3蛋白定位于细胞膜和细胞核。（6）体外酵母双杂和体内双分子荧光互补验证TaMPK3与Ta ICE41蛋白在体外和体内均存在相互作用。