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研究目的本课题旨在研究主动靶向磁纳米粒子(LyP-1-MNPs)的制备方法,并在细胞水平上完成磁感应靶向热疗的生物相容性研究和靶向性验证,在动物水平上研究LyP-1-MNPs磁感应靶向热疗的安全性与有效性。研究方法1.LyP-1-MNPs的制备：采用一步法制备PEG修饰的Fe3O4磁纳米粒子,经活化后在其表面偶联细胞穿膜肽LyP-1。利用傅立叶红外光谱仪(FTIR)、热重分析(TGA)、透射电镜(TEM)、zeta电位与粒度分析仪等分析方法对所制备的PEG修饰的Fe304磁纳米粒子的粒径、形态、蛋白偶联质量比及zeta电位分析等进行表征检测,并将制备样品放置于交变磁场中检测其升温性能,并在室温条件下观察其稳定性和分散性。2.细胞实验：采用RT-PCR和Western Blot的研究方法对高低表达P32蛋白的肿瘤细胞P32蛋白的表达量进行验证；采用CCK-8法研究靶向性磁纳米粒子的细胞毒性；甲苯胺蓝染色和透射电镜(TEM)观察磁纳米粒子在不同细胞内的聚集状态；激光共聚焦(LCSM)检测磁纳米粒子在细胞内的具体定位情况；电感耦合等离子发射光谱仪(ICP-MS)检测单个细胞对磁纳米粒子的摄取量。3.动物实验：制作荷瘤鼠模型；施行实验动物分组,随机分为3组：阴性对照组、热疗组、靶向热疗组。实验组肿瘤原位注射磁流体,热疗后称量体重,绘制体重变化曲线；记录肿瘤体积,绘制肿瘤体积变化曲线。热疗30天后对荷瘤鼠进行安乐死,取心、肝、脾、肺、肾、肿瘤,进行组织切片,HE染色观察靶向磁纳米粒子的体内生物相容性；普鲁士蓝染色观察靶向磁纳米粒子在体内的生物分布情况。研究结果1.制备的磁纳米粒子稳定性和磁响应性良好,经细胞穿膜肽LyP-1修饰后呈规整的球形,粒径有所增加,约15nm,分散性更好；交变磁场下具有良好的升温能力；一步法制备的PEG修饰的磁纳米粒子表面带负电荷,经LyP-1修饰后表面带正电荷。2. RT-PCR和Western-Blot验证了人乳腺癌细胞株MCF-7为一种高表达P32蛋白的细胞株,小鼠结直肠癌细胞株CT-26为一种相对低表达P32蛋白的细胞株。3.所制备的靶向磁纳米粒子无显著细胞毒性,毒性分级为0级或1级,生物相容性好。靶向磁纳米粒子进入细胞的数目高于PEG修饰的非靶向磁纳米粒子进入相同细胞的数目,且高表达P32蛋白的癌细胞MCF-7对靶向磁纳米粒子的摄取量明显高于相对低表达P32蛋白的细胞株CT-26对靶向磁纳米粒子的摄取量。靶向磁纳米粒子在细胞内定位有两种：一部分存在于细胞质中,聚集程度高,推测是吞饮作用或吞噬作用介导的胞吞途径而进入胞内；一部分分散的存在于胞质中或细胞核中,分散性强,猜测是P32蛋白受体介导的内吞途径进入胞内。4.动物实验结果显示,实验组荷瘤鼠的肿瘤体积均得到有效抑制,热疗组荷瘤鼠的治愈率为30%,靶向热疗组荷瘤鼠治愈率为60%,治愈率提高了一倍。病理切片观察显示,磁纳米粒子在生物体内的生物组织相容性良好,未见明显的免疫反应或炎症反应,普鲁士蓝染色观察磁纳米粒子在体内的分布与代谢情况表明磁纳米粒子在治愈后期主要出现在肿瘤部位或肿瘤消退后的原肿瘤部位,在脏器中也有聚集,主要存在于脾、肺、肝中,而又以脾的铁含量最高。研究结论LyP-1修饰的靶向磁纳米粒子具有良好的分散性、磁响应性和升温性能,且生物相容性好,并能有效提高高表达P32蛋白的细胞对靶向纳米粒子的摄取能力。细胞实验和动物实验结果均表明靶向磁性纳米粒用于磁感应靶向热疗是安全的、可行的,磁感应靶向热疗效果是显著的。