论文部分内容阅读
目的：阐明胆酸类成分的稳定性及与蛋白的相互作用等相关性质,为清开灵注射液的质量及胆酸类成分的临床用药提供参考；方法：本实验采用HPLC-ELSD法测定了中间体(胆酸混液、四混液、六混液、八混液)及十批QKL注射液中CA和HDCA的含量；并在含量测定的基础上进行了CA和HDCA原料稳定性影响因素的研究,比较了胆酸类原料与猪去氧胆酸原料在高温(40℃和60℃)、光照(45001x±5001x)、高湿(相对湿度75%±5%和90%±5%)条件下的第0天、第5天、第10天的含量变化,同时在高温(40℃和60℃)和光照(45001x±5001x)两种因素下考察了第0天、第5天、第10天QKL注射液中CA及HDCA的含量变化；并采用了LC-MS联用技术对胆酸类成分的转化产物进行了定性分析；为进一步探讨胆酸类成分的相关性质,本课题采用荧光光谱(FS)结合衰减全反射傅里叶变换红外光谱研究了六种胆酸类成分(CA、DCA、HDCA、 UDCA、CDCA、TCDCA)在pH7.40和离子强度0.15mo1·L-1的模拟生理条件下,根据Stern-Volmer方程、热力学公式、Lineweaver-Burk双倒数方程及同步荧光计算出了BAs与BSA相互作用的猝灭常数、结合常数KLB、结合力类型、结合位点数n及BSA构象变化情况；同时本课题还采用molecular docking技术模拟了六种胆酸小分子与BSA的结合,预测了胆酸类小分子与BSA相互作用的可能部位；并采用含浓度为1mmol·L-1BSA的磷酸盐缓冲液平衡透析法,联合HPLC-ELSD法测定透析袋两侧磷酸盐缓冲溶液中胆酸类化合物的质量浓度,计算CA/HDCA与BSA的结合率。结果：胆酸混液、四混液、六混液、八混液及清开灵注射液中CA的平均含量分别为5.79、0、1.02、2.12、2.07mg·mL-1, HDCA的含量分别为4.59、0、0.81、1.10、0.80mg·mL-1;稳定性影响实验结果表明,原料药中CA和HDCA的含量呈逐渐下降趋势,且HDCA含量相对于CA含量下降更明显,QKL注射液中CA的含量变化不明显,但HDCA含量于第10天有一定的下降,但相对于CA、HDCA原料药而言,QKL注射液中CA、HDCA的含量较为稳定；CA在60℃、湿度RH90%条件下放置5天后部分转化成了DCA, HDCA在60℃、湿度RH90%条件下放置5天后部分转化成了同分异构体CDCA,另一种成分有待研究；光谱法研究结果表明六种胆酸类小分子对BSA的猝灭属于静态猝灭,结合位点约为0.5：1,结合力主要为氢键或Vander Walls力,同步荧光发现BAs对BSA构象影响较小,衰减全反射傅里叶变换红外光谱结果表明酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的相对强度发生变化,但峰位及峰宽变化不明显,进一步验证了BAs对BSA构象影响较小；分子对接结果表明CA、UDCA及TCDCA与BAS结合区域主要位于结构域Ⅱ处,CDCA主要位于BSA结构域Ⅰ处,DCA与位于BSA结构域Ⅰ与结构域Ⅲ处的氨基酸形成氢键,而HDCA与位于BSA结构域Ⅱ与结构域Ⅲ处的氨基酸形成氢键；结合率实验结果显示在CA、HDCA质量浓度均分别为2.02、1.01、0.505mg·mL-1时,CA与BSA结合率分别为78.7%、78.2%、59.4%,HDCA与BSA结合率分别为68.9%、76.2%、81.8%,结论：QKL注射液中的配伍关系及pH值有利于CA和HDCA的稳定；胆酸类小分子与牛血清白蛋白之间具有一定的结合作用,这为胆酸类小分子在体内被蛋白质储存和转运提供了条件；CA/HDCA与BSA具有中等强度的结合率,说明胆酸类化合物在体内不易因游离浓度过大而产生副作用；同时阐明了胆酸类小分子与牛血清白蛋白相互作用的机制为进一步探讨胆酸类小分子在生物体内与蛋白质的作用机理和生物学效应提供了理论依据。