研究背景：肝脏作为人体最大的代谢、消化器官，具有强大的再生功能，在损伤期间其肝内干细胞被激活，参与修复肝脏的损伤，而再生细胞可能在修复损伤的过程中产生错配，成为肝癌起源的重要发生机制之一。为了探索肝干细胞恶性转化的过程，我们研发并构建了基于全基因组水平的19个随机碱基RNA文库（n19 RNA library），用于筛选并鉴定调控肝干细胞恶性转化的非编码RNA，并进一步研究其调控机制，以期为治疗肝癌提供实验与理论依据。　　方法：（1）将19个随机碱基 RNA文库通过逆转录病毒系统转入12.5 d的鼠胚胎肝干细胞（iHpx）中，得到稳定表达n19的iHpn19细胞，在体外扩增后进行裸鼠皮下注射，9周后收取皮下包块，体外培养后得到贴壁生长的iHpn19A细胞，体外扩增后再次进行裸鼠皮下注射，再提取贴壁生长的细胞，经过5次体内外的扩增与筛选，将每次回收到的细胞分别命名为iHpn19A, iHpn19B, iHpn19C, iHpn19D, iHpn19E，以iHpx细胞作为对照。　　（2）将体内外筛选得到的5代细胞与对照组细胞进行体外扩增，在光镜下观察其形态变化；运用过碘酸希夫染色（PAS）实验检测其合成糖原能力；吲哚菁绿摄取释放染色实验检测其肝细胞功能变化；qPCR检测肝干细胞干性marker和肝脏相关性marker的表达。　　（3）将体内外筛选得到的5代细胞与对照组细胞进行体外扩增后进行裸鼠皮下注射，将不同时间点获取的瘤块包埋后进行病理学分析。　　（4）提取体内外筛选得到的5代细胞基因组DNA，对RNA序列进行高通量二代测序，大数据分析后将高度富集的片段命名为Hpx1-4，分析其共同靶向的 LncRNA，qPCR检测并验证这些 Lnc在各代细胞中的表达情况，分析与其序列高度相似的microRNA，借助microRNA的数据库对瘤样表型细胞的生成进行进一步探索。　　（5）设计并构建靶向鼠BMP9 CDS区的5段siRNAs，包装成腺病毒后感染间充质干细胞 iMADs，体内外验证这5个 siRNA片段在BMP9诱导的情况下对早、晚期成骨分化的影响，从而选出最抑制效应最强的RNAi片段。　　结果：（1）我们自主创新构建的全基因组RNA文库，深度测序结果验证其有效性达90%，多样性高达2.0~3.0×107，可有效转染目的细胞；RNA文库转染不成瘤iHpx细胞后通过体内外多轮筛选得到具有瘤样表型的肝样细胞。　　（2）体外实验可见，与 iHpx细胞对比，多轮筛选得到的细胞形态从鹅卵石样逐渐变成梭形样细胞，疑发生纤维样细胞变化或EMT，细胞群中大部分瘤样细胞维持着干性marker的表达，少部分具有肝细胞的功能。体内实验证实，iHpn19系列细胞的增殖速度随着筛选轮次的递增而加速，发生了明显的瘤样变化。　　（3）高通量二代测序的结果及数据分析显示，多轮筛选得到的细胞高度富集4个RNA片段，分别命名为Hpx1、Hpx2、Hpx3、Hpx4，预测这4个片段共同靶向的12个LncRNA，qPCR进一步检测这12个LncRNA在不同轮次筛选细胞中的表达水平。　　（4）在 BMP9诱导 iMADs细胞的成骨分化过程中，simB9-4和simB9-7显示出不同程度的抑制成骨分化效应，而当二者协同作用时可以发挥最大的抑制效应。进一步验证了 BMP9在成骨分化中的重要作用。　　结论：（1）利用RNA文库在体内外的筛选，成功获得具有瘤样表型的肝干细胞模型，其增殖分化失衡可能导致肝细胞癌。　　（2）高通量二代测序分析 RNA文库的筛选后具有瘤样表型的肝细胞，成功发现了在导致胚胎肝干细胞增殖分化失衡过程中起关键调控作用的LncRNA，这些LncRNA对肝细胞增殖分化的调控可能导致了具有瘤样表型的肝干细胞出现。　　（3）BMP9在诱导间充质干细胞成骨分化过程中扮演着关键的角色，而通过simB9-4和simB9-7靶向抑制BMP9 CDS靠5’区序列后，其诱导iMADs细胞的成骨分化作用被不同程度抑制，而二者协同作用时可以发挥最大的抑制成骨分化效应。