乳酸菌是公认的食品安全级微生物，其所产胞外多糖是乳酸菌生长代谢过程中产生并分泌于胞外的一种糖类化合物，有多种功能活性，是当今研究热点之一。本实验室从芬兰传统发酵乳Viili中分离鉴定得到的一株副干酪乳杆菌VL8，研究发现其胞外多糖具有良好的抗氧化活性。本实验以副干酪乳杆菌VL8胞外多糖(VL8-EPS)为研究对象，以巨噬细胞RAW264.7为靶细胞，运用细胞和分子生物学技术，从体外水平研究VL8-EPS的免疫调节活性及其作用机制，为功能性产品的研发提供理论基础。采用CCK-8法测定VL8-EPS对RAW264.7细胞增殖-毒性作用;采用Diff快速染色法观察细胞形态;通过比色法及WST-1法测定诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活力，微量法及钼酸显色法检测超氧阴离子(O2-)及过氧化氢(H2O2)的分泌量，初步探讨VL8-EPS对巨噬细胞的激活机理;随后，荧光定量PCR法在基因水平上检测主要细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10mRNA的表达;为了进一步研究VL8-EPS的免疫调节机制，采用荧光定量PCR、免疫荧光染色技术、Western blotting技术从分子水平研究VL8-EPS对TLR4/NF-κB/MAPK信号通路的调控作用;最后通过抑制剂阻断试验观察TLR4、NF-κ3、MAPK在VL8-EPS调节巨噬细胞免疫功能中的作用。主要研究结果如下:
　　1.VL8-EPS在50～800μg/mL浓度范围内对RAW264.7细胞无毒性，能够激活静息状态下的RAW264.7细胞，促进其形态发生改变。剂量依赖性提高细胞内SOD酶、iNOS酶活力，促进细胞分泌O2-和H2O2活性氧。在800μg/mL时，较空白对照组分别提高了104.64％、10.30％、666.87％、81.78％。说明VL8-EPS通过提高胞内酶活性及释放活性氧激活RAW264.7细胞从而发挥免疫增强作用。
　　2.VL8-EPS促进了RAW264.7细胞内IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10mRNA的表达，说明VL8-EPS可能通过上调细胞因子mRNA的表达，从而促进细胞因子的释放，提高机体免疫调节能力。
　　3.VL8-EPS能够促进TLR4mRNA的表达，说明TLR4是RAW264.7细胞识别VL8-EPS的主要模式识别受体。TLR4特异性抑制剂阻断试验进一步证明VL8-EPS通过细胞表面TLR4受体识别进入细胞，并且参与了NO的调控。
　　4.免疫荧光结果表明，VL8-EPS能够促进NF-κB p65亚基核转位。Western blot结果表明，提高IKKβ蛋白的表达和IκBα、p65的磷酸化，提高了ERK1/2、JNK、p38蛋白的磷酸化水平。说明，VL8-EPS能够激活RAW264.7细胞的NF-κB、MAPK信号通路。
　　5.NF-κB、p38、ERK1/2、JNK特异性抑制剂阻断试验，证明了VL8-EPS刺激RAW264.7细胞产生IL-1β、TNF-α和IL-10受NF-κB、p38、ERK1/2通路的调控，而不受JNK通路的调控。IL-6的分泌同时受NF-κB、p38、ERK1/2和JNK通路的调控。
　　结论:
　　VL8-EPS能够激活RAW264.7细胞，具有免疫调节能力。其作用机制是通过激活TLR4/NF-κB/MAPK信号通路调节巨噬细胞分泌细胞因子，从而调节机体免疫。这为开发利用VL8-EPS作为天然免疫佐剂提供了必要的理论依据。