[研究背景]树突状细胞（Dendritic cell，DC）是专职抗原提呈细胞之一。依据其成熟状态、表型或来源不同，在免疫或耐受的诱导中起着关键作用。DC捕捉，处理，传递抗原到淋巴器官，在淋巴器官与T细胞相互作用，引起抗原特异性的免疫反应或免疫耐受。T细胞受体（T cell receptor，TCR）识别抗原肽-MHC分子复合物、足够的共刺激分子及自分泌、旁分泌的细胞因子的参与，导致T细胞活化，诱导免疫应答。缺乏这些信号分子则使T细胞不能完全活化，诱导免疫耐受。成熟的树突状细胞表达高水平的MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子，导致T细胞活化。与此相反，不成熟的树突状细胞缺乏共刺激信号，因此诱导同种异体抗原特异性低反应，延长同种异体移植物存活。阿司匹林，维生素D3或白细胞介素-10可体外诱导生成不成熟的树突状细胞。然而，这些体外培养的不成熟树突状细胞，当暴露于体内的炎性刺激时，可能转变成成熟的树突状细胞，导致免疫刺激而不是免疫抑制。最近研究表明，骨髓来源的树突状细胞与IL-10及细菌脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）培养刺激下表现为一种半成熟状态，即表达低水平的共刺激分子，或称为旁路活化的树突状细胞（Alternativelyactivated DC，aaDC）。这些半成熟的树突状细胞即使在炎性条件下也是不可逆转的，因此诱导抗原特异性T细胞无反应，延长同种异体移植存活。然而，这些半成熟树突状细胞免疫调节的分子机制仍不清楚。PD-1（Programmed cell death protein 1，PD-1）受体是表达在活化T细胞上的抑制性共刺激分子，属于CD28家族成员，在免疫反应的调节及外周耐受方面起着重要作用。PD-L1表达在多种抗原提呈细胞。PD-L1可以通过与活化T细胞上的PD-1结合，抑制T细胞增殖，并促进活化T细胞的凋亡。最近的研究表明，PD-1／PD-L途径在动物同种异体移植模型中起着重要作用。虽然树突状细胞表达PD-1受体的两种配体，即PD-L1和PD-L2，但是PD-1／PD-L途径是否在半成熟树突状细胞引起的免疫耐受中起作用仍不清楚。本研究拟从PD-1／PD-L信号通路角度，探讨小鼠骨髓来源的半成熟树突状细胞（即aaDC）在小鼠皮肤移植模型中的耐受机制。[研究方法]1．不同类型小鼠骨髓来源的树突状细胞的制备培养与受者小鼠静脉输注小鼠骨髓来源的树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cell，BMDC）制备参照文献。分离小鼠后腿股骨和胫骨骨髓细胞，用NH4Cl低渗缓冲液裂解红细胞，细胞计数后以2×10⁶个细胞接种在100mm的细胞培养皿中，培养基为含20 ng／ml rGM-CSF（Pepro Tech Inc，New Jersey，USA）的RPMI-1640完全培养基，37℃5％CO2培养箱中培养7天，获得所谓未处理的DC（untreated DC），培养期间每间隔1天换1次培养基。为诱导产生不成熟DC（immature DC，imDC），在培养第6天，加入20 ng／ml rmIL-10（Pepro Tech Asia，Rehovot，Israel）培养1天；而aaDC的制备是在第7天在imDC培养基中加入1μg／ml LPS（L4130，Sigma-Aldrich），培养1天后即为aaDC；而成熟DC的获得采用1μg／ml LPS刺激未处理DC 1天。为测试以上制备的4种不同类型DC对同种异体皮肤移植物存活时间的影响，在移植前7天，分别将BALB／c供者小鼠来源的上述4种DC经尾静脉输注到受者小鼠（C57BL／6）体内，细胞数为2×10⁶／只小鼠。同时采用抗PD-1抗体阻断PD-1／PD-L信号通路以观察其对aaDC调节效应的影响，而以同型IgG为对照。抗体应用方法如下：在aaDC输注当天腹腔注射500μg／只（day 0），在随后第2、4、6天各250μg／只腹腔注射，，共分7个实验组（每组6只小鼠）：group 1：untreated DC；group 2：imDC；group 3：aaDC；group 4：aaDC plus anti-PD-1 mAb；group 5：anti-PD-1 mAbalone：group 6：mDC and group 7：aaDC plus control IgG．2．采用流式细胞术分析DC表型DC首先与anti-CD16／CD32 mAb孵育以封闭FcγR，然后用荧光素标记的抗CD11c、CD80、CD86、MHCⅡ、PD-L1以及PD-L2分别孵育（4℃，30 min），然后用PBS洗涤2次，采用流式细胞仪分析[FACSCalibur^TM flow cytometer（BectonDickinson）]。3．小鼠皮肤移植术参照Billingham and Medawar方法。受者小鼠（C57BL／6）麻醉后，剪除背部皮肤毛发，准备直径12mm的植床。颈椎断离法处死供者小鼠（BALB／c），剪除躯干毛发，取直径12mm皮片，去除皮下脂肪，将皮片移植缝合到受者小鼠（用5—0#丝线采取8针不连续缝合法），用创可贴包被伤口，每天观察1次移植皮肤的存活情况，如果50％皮片翻起或坏死即为排斥。同时选择性应用组织病理分析证实排斥的发生。4．组织学分析参照文献。皮肤移植物切下后，用4％福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色后进行病理组织学分析，观察炎症细胞浸润程度。5．ELISA检测细胞因子浓度根据使用说明书介绍的方法，采用ELISA试剂盒（Biosource International，Camarillo，CA）检测混合淋巴细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、IL-10含量。6．混合淋巴细胞反应刺激细胞为来源于BALB／c小鼠的各种类型DC。DC细胞经丝裂霉素C处理后接种于96孔V型底培养板。来源于C57BL／6受者小鼠脾脏细胞，经尼龙棉纯化获得T淋巴细胞，用CFSE标记后作为反应细胞。4×10⁵个反应细胞与4×10⁵刺激细胞混合后，在37℃、5％CO₂条件下培养5天，收获细胞，用流式细胞术分析CFSE荧光强度以评判T细胞增殖程度。7．流式细胞术检测CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Tregs混合淋巴细胞培养5天后收集细胞，用anti-CD4-FITC、anti-CD25-PE进行细胞表面标记染色，细胞经透膜后用APC-labeled anti-Foxp3标记（Foxp3 StainingBuffer Set，eBioscience），用流式细胞仪分析CD4⁺CD25⁺ T细胞表达Foxp3的水平（23）。8．流式细胞术检测细胞内细胞因子制备单个脾脏细胞，在体外37℃、5％CO₂培养条件下，用50 ng／ml PMA，1μg／ml ionomycin、2μM monensin（all Sigma-Aldrich）刺激处理4小时后收获细胞，经FITC标记抗CD4或CD8染色后，4％formaldehyde固定、透膜处理后用相应荧光素标记细胞因子抗体染色，流式细胞仪检测细胞因子表达水平。9．统计分析实验数据采用单向方差分析法，P＜0．05为统计学显著差异。不同处理组间移植物存活时间差异分析采用Kaplan and Meier法（24）。[结果]1．部分成熟为aaDC表型特点对几种类型DC表型分析发现，与不成熟DC（imDC）和未处理DC（untreatedDC）相比较，aaDC表达CD80、CD86水平有一定程度增加，而MHCⅡ分子表达水平相当。然而，以上分子的表达水平比成熟DC（mDC）明显降低。值得注意的是，我们观察到aaDC表达PD-L1和PD-L2的水平与不成熟DC和未处理DC比较显著升高（图1）。2．aaDC刺激同种反应T细胞增殖的能力降低，该特性与PD-1／PD-L信号通路有关随后，我们通过混合淋巴细胞反应实验证实，如图2所示，aaDC（来源于BALB／c小鼠，H-2^d）刺激同种反应性T细胞（来源于C57BL／6，H-2^b）增殖的能力明显低于成熟DC，与未成熟DC相当。重要的是，当用抗PD-1抗体阻断PD-1／PD-L信号通路后，aaDC刺激同种T细胞增殖的活性增强，提示PD-1／PD-L共抑制信号通路参与aaDC对同种T细胞反应的调节。3．在混合淋巴细胞培养体系中，aaDC诱导抗炎性细胞因子IL-10分泌增加而抑制IFN-γ的产生，该效应部分依赖于PD-1信号通路我们采用ELISA检测上述混合淋巴细胞培养上清液中细胞因子IL-10和IFN-γ产生水平，发现aaDC作为刺激细胞时，能诱导出比成熟DC和未处理DC显著升高（p＜0．01），几乎与未成熟DC相当浓度的IL-10；与此相反，与未处理DC相比较，aaDC、未成熟DC能显著抑制混合淋巴细胞反应炎症性细胞因子IFN-γ的产生（p＜0．01）。有趣的是当用抗PD-1抗体阻断后，可以逆转该调节效应（图3），上述结果表明aaDC对以上细胞因子的调节也部分依赖于PD-1信号通路。4．aaDC具有扩增CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞的特性因为已有文献报道调节性DC能诱导调节性T细胞（Treg）的产生。因此，我们进一步检测了混合淋巴培养体系中不同类型DC细胞诱导Treg产生的差异性。结果表明（图4），与其它类型DC相比较，aaDC扩增CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg的功能最强（p＜0．01），该调节效应涉及PD-1信号通路，其次是不成熟DC，而成熟DC以及未处理DC对Treg的诱导产生能力弱。5．静脉输注供者来源的aaDC能明显炎症皮肤移植物的存活时间，而且PD-1／PD-L信号通路参与aaDC的调节作用依据上述体外实验结果，我们进一步探讨在同种异体皮肤移植前7天，输注供者来源的各种类型DC到受者体内（2×10⁶个细胞／只小鼠），观察其对皮肤移植物存活时间的影响。结果发现（图5），与其它DC细胞{untreated DCs（MST 11．83±2．40days），imDC（MST 16．00±3．10 days）or mDC（MST 7．50±1．64 days）}相比较，aaDC输注能显著延长移植物的存活时间（MST 22．67±4．08 days）（P＜0．01）。有趣的是，当用抗PD-1抗体阻断PD-1／PD-L信号通路后，aaDC对移植物的保护效应显著降低（MST22．67±4．08 vs 12．33±3．33 of aaDC+anti-PD．1，P＜0．01）。单独应用抗PD-1抗体对移植物的存活时间影响很小，与未处理DC的效应相当（MST 10．83±2．79 vs 11．83±2．40days，p＞0．05）。6．组织病理学分析证实aaDC输注能显著减轻皮肤移植物中炎症细胞浸润在皮肤移植后7天，对移植皮肤进行病理组织学分析，如图6所示，发现输注aaDC能显著减轻移植皮肤中炎症细胞浸润，imDC也能在一定程度上降低炎症细胞的浸润。而与此相对照，输注成熟DC（mDC）以及未处理DC后，皮肤移植物中仍有明显的炎症细胞浸润。aaDC输注加抗PD-1抗体能降低其对移植物的保护效应，而单独应用抗PD-1抗体或同型对照IgG对炎症细胞浸润的影响较小。以上病理组织学结果与移植物的存活时间相一致。7．aaDC输注能改变受者小鼠脾脏T淋巴细胞产生细胞因子谱的特征为了探讨供者来源的各种不同类型DC输注后，能否影响受者脾脏T淋巴细胞产生细胞因子的类型。进一步分离了输注不同类型DC后的各组受者小鼠的脾脏T淋巴细胞，体外在经PMA／ionomycin刺激后，采用流式细胞术分析T细胞内细胞因子（IL-2、IL-10和IFN-γ）表达水平。如图7A所示，与其它类型的DC相比，输注aaDC后受者小鼠脾脏CD4⁺T细胞产生IL-2的能力降低(^**p＜0．01)，而IFN-γ有一定程度升高。与此相反，aaDC能增强受者脾脏CD4⁺T细胞产生IL-10。有趣的是，我们观察到输注aaDC后，与其它组相比较，受者小鼠脾脏CD8⁺T细胞IFN-γ的分泌潜能显著降低（_*^* p＜0．01），而对CD8⁺T细胞IL-2的产生无明显影响（图7B）。同样地，当应用抗PD-1抗体阻断PD-1／PD-L信号通路后，对aa DC的免疫负调节效应有明显的抑制作用。[结论]通过输注供者来源aaDC能显著延长异基因小鼠皮肤移植物存活时间，抑制受者同种反应性T细胞增殖，减轻移植物组织中单个核细胞浸润。aaDC的免疫调节机制可能涉及扩增CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞，增强受者脾脏同种反应T细胞产生抗炎性细胞因子IL-10，而抑制与T细胞增殖密切相关的IL-2的产生，炎症性细胞因子IFN-γ也明显受到抑制，有趣的是，PD-1／PD-L信号通路对以上aaDC的免疫调节作用起着关键作用。本研究成果提示，采用aaDC过继输注可抑制同种移植物排斥反应，为防治同种异体器官移植排斥反应提供了新的干预策略，进一步深化了对aaDC免疫调节机制的认识。