论文部分内容阅读
目的‘探讨miR-499a及靶基因在肝癌细胞中的关系。方法1.通过实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测miR-499a在HepG2与HepG2.2.15细胞中、表达HBV的腺病毒瞬时感染HepG2细胞(Ad-HBV-HepG2)与其对照组感染GFP的HepG2细胞(Ad-GFP-HepG2)中的表达。2.构建miR-499a的过表达质粒(pTARGET-miR-499a)并且运用Real-time PCR的方法验证过表达效果,通过miRNA靶基因预测软件如TargetScan和miRDB,筛选到miR-499a靶基因CFLAR,构建靶基因CFLAR的3’UTR(3’端Untranslated Regions)野生型和突变型荧光素酶报告质粒,运用荧光素酶报告系统检测靶基因CFLAR与miR-499a的相互作用。3.通过Real-time PCR在mRNA水平和Western-blot在蛋白质水平验证CFLAR是否为miR-499a的靶基因。购买miR-499a的抑制剂miR-499a inhibitor,通过Real-time PCR的方法验证干扰效果,再运用Real-time PCR和Western-blot实验进一步验证CFLAR是miR-499a的一个靶基因。4.通过qRT-PCR和Western Blot检测HBV对CFLAR表达的影响。结果1.miR-499a在HepG2.2.15细胞中的表达高于HepG2细胞,在Ad-HBV-HepG2细胞中的表达高于Ad-GFP-HepG2细胞。2. miR-499a通过结合CFLAR的3’UTR来抑制其表达。3.在SMMC7721细胞中过表达miR-499a, CFLAR在mRNA和蛋白水平表达降低。干扰miR-499a的表达,CFLAR在mRNA和蛋白水平表达升高。4.HBV抑制CFLAR的表达。结论在肝癌细胞中HBV能上调miR-499a的表达,CFLAR是miR-499a的靶基因之一,HBV可以通过上调m1R-499的表达抑制CFLAR的表达。